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目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,其预后较差,生存率低,如何改善预后,提高生存率是临床上亟待解决的问题。DC是体内功能最强的专职抗原提呈细胞,在抗肿瘤免疫中起重要作用。负载肿瘤抗原的DC疫苗可以诱导出特异性抗肿瘤免疫效应,这在许多动物及部分临床实验中已经得到证实。但现在常用的DC疫苗只是取得了部分效果,其原因可能与其抗原递呈及活化T细胞的能力较弱有关。从肿瘤组织中提取的gp96结合有多种肿瘤特有的抗原肽,抗原肽可通过DC表面gp96受体,进入MHCⅠ类分子递呈途径,激发较强的免疫应答。gp96肿瘤疫苗的实验研究正在展开,研究显示用gp96-多肽复合物作为疫苗进行抗肿瘤实验,取得了较明显的效果。然而,在肿瘤患者体内,DC数量减少,功能缺陷,直接用gp96-多肽复合物作疫苗,其抗原提呈效力受到影响。因此,在体外用gp96-多肽复合物负载DC后制备的DC疫苗有可能会产生更好的效果,目前尚未见这方面的报道。为此,本课题首先探讨gp96在胃癌组织中的表达及其临床意义;从胃癌组织中纯化gp96-多肽复合物负载DC,以观察gp96-多肽复合物DC疫苗的生物学特性及特异性抗胃癌CTL反应,并对其作用机制进行初步探讨。方法:1.收集第三军医大学附属西南医院普外科2002年1月至2002年10月间行外科手术切除的50例新鲜胃癌标本,以及同一患者距肿瘤约3～5cm的癌旁正常组织,50例标本均经病理证实为胃癌;应用免疫组化及原位杂交技术,检测gp96在胃癌组织中的表达,并分析其与临床病理类型的关系。2.应用液相层析方法从胃癌组织中纯化gp96-多肽复合物;用SDS-PAGE和Western blot进行性质鉴定;将纯化得到的gp96-多肽复合物负载自体外周血来源的DC,制备gp96-多肽复合物DC疫苗,并与负载冻融粗提抗原的DC疫苗和未负载肿瘤抗原的DC作对比;采用流式细胞技术对gp96-多肽复合物DC疫苗进行表型检测。3. 采用3H-TdR掺入法检测gp96-多肽复合物DC疫苗诱导的T淋巴细胞增殖能力;ELISA技术检测gp96-多肽复合物DC疫苗培养上清中IL-12的水平以及gp96-多肽复合物DC疫苗致敏的效应T细胞分泌IFN-γ和IL-10的能力;酶消化法原代培养同一患者的胃癌细胞,并以胃癌细胞株SGC7901和无关肝癌细胞株HepG2作对照,采用51Cr释放实验检测gp96-多肽复合物DC疫苗诱导的特异性对胃癌细胞的杀伤效应。 <WP=12>结果:1.胃癌组织和癌旁正常组织内均表达gp96,胃癌组织的表达显著高于癌旁正常组织(P< 0.01);gp96的表达与组织学类型显著相关,不同分化程度的胃癌组织之间,gp96的表达存在显著差异(P< 0.05);与肿瘤分期显著相关,临床Ⅲ、Ⅳ期显著高于Ⅰ、Ⅱ期(P< 0.05);与淋巴结转移显著相关,有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者(P< 0.05);而gp96表达与性别、年龄及肿瘤部位无显著相关(P>0.05)。2.用亲和层析及两次离子交换层析可从胃癌组织中纯化出gp96-多肽复合物,经SDS-PAGE和Western blot得到鉴定;负载gp96-多肽复合物的DC疫苗其表面分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR的表达分别为79.3±4.1%、84.3±2.4%、85.7±3.2%和83.4±2.9%,显著高于对照组(P< 0.05)。3. gp96-多肽复合物DC疫苗刺激T淋巴细胞增殖的能力比对照组显著增强(P< 0.01);其培养上清中IL-12的含量为788.3(6.7pg/ml,显著高于对照组(P< 0.01);gp96-多肽复合物DC疫苗诱导的效应T细胞分泌IFN-γ的量为2875(177.66 pg/ml,显著高于对照组(P< 0.01),分泌IL-10的量为36(6.72pg/ml,显著低于对照组(P< 0.01),二者之间存在显著的负相关关系(r= - 0.915, P<0.01);gp96-多肽复合物DC疫苗诱导的自体抗原特异的CTL对原代培养胃癌细胞的杀伤效率为58.47±10.71%,显著高于对照组(P< 0.01);对原代培养胃癌细胞的杀伤效率显著高于对SGC 7901细胞(P< 0.01);而对其它无关肿瘤细胞则无明显杀伤作用。结论:1.gp96在胃癌组织和癌旁正常组织内均有表达,在胃癌组织的表达显著高于癌旁正常组织,并且与组织学类型、肿瘤分期及淋巴结转移相关,提示gp96的表达与胃癌的发生、发展密切相关,其表达水平可以作为判断胃癌预后的参考指标之一。2.从胃癌组织中可以纯化出gp96-多肽复合物,DC负载gp96-多肽复合物后可明显上调其表面分子的表达。3.gp96-多肽复合物DC疫苗具有较强的刺激T淋巴细胞增殖及分泌IL-12的能力。4.gp96-多肽复合物DC疫苗可促进效应T细胞产生IFN-γ及抑制IL-10的产生,提示可诱导Th0细胞向Th1漂移,对Th1细胞介导的抗肿瘤免疫具有增强作用。5.gp96-多肽复合物DC疫苗能诱导出较强的对自体胃癌细胞的CTL反应,对其它无关肿瘤细胞则无显著作用,提示gp96-多肽复合物DC疫苗所诱导的CTL反应具有高度的特异性。6.gp96-多肽复合物由于结合有肿瘤细胞特有的各种抗原肽,在目前很难鉴定来自肿瘤组织特异抗原的情况下,以这种携带全部抗原信息的个体化疫苗治疗肿瘤可作为一个较好的选择。