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癌症,即恶性肿瘤,是当今社会致死率最高的疾病。国际抗癌联盟发布的数据表明,2008年,全球有1270万人患癌,死亡人数高达760万。在我国,每年有180万人因癌症丧生。因此,发展用于癌症早期诊断和相关癌症标志物筛查的方法具有重要的临床意义。代谢组学(metabonomics/metabolomics)是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科,是系统生物学的重要组成部分,它己被广泛用于多种疾病的诊断、相关标志物筛查和病理生理学解释等方面。目前,核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,NMR)和质谱法(Mass Spectrometry,MS)是最常用的两种代谢组学分析技术。与NMR.相比,MS由于具有高灵敏度、高准确性、宽动态范围、可得到化合物准确分子量、易于与各种色谱联用、鉴定能力强等优点,近年来已经成为代谢组学研究中不可或缺的一种手段。
本论文着重发展了基于质谱技术的血清代谢组学分析平台,将其应用于癌症诊断、标志物筛查以及病理学解释等方面。以下是主要研究内容和成果:
1、基于直接注入式质谱法(Direct Injection Mass Spectrometry,DIMS)和液相色谱一质谱联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)技术的代谢组学研究。在基于质谱技术的代谢组学分析方法中,虽然LC-MS的分析技术是目前最常用的,但是与色谱的联用限制了该方法的高通量性,同时也增加了数据处理的复杂性。近年来,随着高分辨率质谱的发展,人们开始尝试不经过色谱分离,而采用直接注入的方式来对样品进行质谱分析,初步结果令人满意。本工作以肾癌患者和健康人血清样品为模型,考察上述两种分析方法在实际应用中的性能差异。在肾癌预测和诊断方面,DIMS可以得到与LC-MS相当的结果,考虑到该种分析方法的高通量性(＜2 min),其有望成为肾癌快速诊断的新手段。而在癌症标志物发现方面,通过DIMS方法发现了14种潜在标志物,而LC-MS方法则发现了29种,且前者发现的标志物在后者中均有发现,这说明LC-MS方法更适合于疾病相关标志物的全面筛查。
2、LC-MS分析技术对肾癌标志物的全面筛查。本工作采用反相色谱(Reversed Phase Liquid Chromatography,RPLC)和亲水相互作用色谱(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography,HILIC)分别与质谱联用的方法,考察了两种分离技术共同使用的必要性。结果表明,亲水相互作用色谱可以分离反相色谱所不能保留的强极性化合物,两种分离技术的配合使用有利于血清样品的全面分析,整合后的新数据集可以得到更好的聚类和预测结果。该研究所发展的分析方法不仅可以用于肾癌的早期预测和诊断,还展示出了进行肾癌病理学分期的潜力。此外,本工作共发现了46种肾癌潜在标志物并鉴定了其中的30种。对这些标志物的代谢路径的研究结果表明,肾癌患者体内存在异常的磷脂代谢、鞘脂类代谢、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、脂肪酸转移与氧化、胆固醇代谢以及花生四烯酸代谢等过程。这些标志物的发现不仅有利于更好地理解肾癌患者的病理生理学变化,同时也提供了潜在的饮食或化学疗法信息。
3、泌尿系统多种癌症的诊断及特异性标志物的筛查。目前,在绝大多数的代谢组学研究中,对诊断方法和标志物的评估还局限在对健康人和所研究的疾病病人的比较上,这种狭隘的评估方法直接导致了标志物缺乏特异性的研究通病,这也成为代谢组学发展所面临的一个十分棘手的问题。在此背景下,本工作首次对两类泌尿系统癌症进行同时研究,并发展了一套可供借鉴的标志物筛查和评估方法。在该研究中,为了实现客观的评估,实验所用到的测试集中除了包含肾癌、膀胱癌患者和健康人的血清样品外,还包含了其他泌尿系统癌症患者和非恶性泌尿系统疾病患者的样品。研究表明:在训练集的对照组中加入非恶性疾病的患者对提高诊断方法和标志物的特异性是十分必要的;优化后的模型可以实现对肾癌和膀胱癌的高灵敏度和高特异性的检测,初步展示了该方法对泌尿系统不同类型癌症进行同时诊断的能力。此外,通过严格的筛查,分别发现了5种膀胱癌特异性标志物、5种肾癌特异性标志物和7种癌症共同的标志物。采用受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC)对标志物的灵敏度和特异性进行评估,结果表明这些标志物具有用于癌症临床诊断的潜力。
4、直接注入式傅立叶变换质谱法(Direct Infusion Fourier Transform MassSpectrometry,DI-FT-MS)对癌症的快速诊断。FT-MS是性能最为杰出的高端质谱仪,其特有的超高分辨率和准确性使其十分适合于直接进样的分析方法。本研究在前期工作的基础上,发展了适合于血清样品代谢组学分析的DI-FT-MS技术,旨在探讨其对不同类型癌症快速诊断的可能性。我们的研究结果表明:不同类型的泌尿系统癌症具备显著的代谢谱差异;而基于DI-FT-MS的检测技术通过结合多变量的数据分析方法,就能够有效地对差异谱进行检测,从而实现对不同类型泌尿系统癌症的准确诊断。