[研究背景]自身免疫性肝炎(AIH)是三种自身免疫性肝脏疾病之一，在各种族、年龄段和性别均有发病，以女性和儿童多见。AIH病人对免疫抑制治疗的反应非常好，但是，如果不及时治疗，则预后比较差(Krawitt 1996)。因此，该病预后的关键是早期正确的诊断。然而，目前尚没有一项理想的、特异性实验室诊断指标。其诊断须结合血清学检查(高IgG)、肝活检、临床表现及非特异性自身抗体(ANA、SMA、pANCA和LKM等)的存在进行综合判断。在所有的AIH病人中，约20﹪的病人出现抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(抗-SLA/LP)抗体，这是目前唯一的一项具有100﹪特异性的实验室指标(Wies et al.2000)。 可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)是一种可溶性细胞浆蛋白，分子量约50kDa，在体内各组织中包括胚胎中广泛表达，但在肝、胰、肾、肺等酶代谢活跃的器官高表达，活化的T细胞也过量表达，推测其可能为一种或一组酶(Wies et al.2000)。另有研究指出，SLA与UGA serine tRNA-protein complex有关，可能是硒代半胱氨酸代谢途径的重要一员(Costa et al.2000)。SLA/LP的化学本质和生物学功能直到最近才被实验证实。研究发现，SLA/LP蛋白是真核生物和古生菌中硒蛋白合成过程中的一个关键酶一磷酸丝氨酰-tRNA：硒代半胱氨酰-tRNA合成酶，催化磷酸丝氨酰-tRNA转化为硒代半胱氨酰-tRNA，从而将用于蛋白质合成的第21种氨基酸～硒代半胱氨酸运输到核糖体，合成硒蛋白(Chambers et al.1986；Zinoni et al.1986；Yuan etal.2006；Xu et al.2007)。目前，对SLA/LP蛋白的表达调控知之甚少，尚未见相关文献发表；同时对sLA/LP蛋白在AIH中的自身免疫作用机理也不清楚。因此，如果对sLA/LP了解的多一些，对明白SLA/LP的自身免疫性及AIH的发病机理都会有帮助。为此，本课题计划建立sla/lp基因敲除鼠模型，并对sla/lp基因的启动子进行定位，寻找存在的转录因子，并确定其在SLA/LP蛋白表达中的调控作用。 第一部分：sla/lp基因敲除鼠模型的建立[研究目的] 创建sla/lp基因敲除鼠模型，研究其表型变化，进一步阐明SLA/LP功能，同时为SLA/LP功能及AIH的相关研究提供一个比较理想的动物模型。 [研究方法] (1)利用基因克隆技术，构建基因敲除载体。(2)将基因敲除载体电转到胚胎干细胞(Rl ES)中，通过同源重组完成基因序列的置换。(3)药物筛选耐药克隆，Southern Blot筛选阳性重组子克隆。(4)用显微注射方法，将发生重组后的ES细胞注射到来自C57BL/6鼠的3.5天的囊胚中，并移植到代孕母鼠体内，以产生嵌合体小鼠。(5)将雄性嵌合体小鼠与野生型雌性C57BL/6小鼠交配，获得杂合体小鼠。(6)将杂合体小鼠交配，获得基因敲除纯合体小鼠。(7)分析基因敲除鼠的表型变化。 [结果] 构建的基因敲除载体含有两个同源序列，分别称作5’Arm和3’Arm。5，Arm长2007bp，含有从内含子2-3到外显子3的序列；3’Ann长4256bp，含有从内含子6-7到外显子8的序列。同源重组后，将敲掉自外显子3到内含子6-7之间长约5867bp的一段序列。在5，Arm后，加入了EGFP基因；在两个同源序列之间含有阳性选择标记-新霉素基因；在两个同源序列之外含有阴性选择标记．单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，用于阳性重组胚胎干细胞克隆的药物筛选。将构建的基因敲除载体电转到ES细胞中后，用G418和ganciclovir筛选耐药克隆。在400多株耐药克隆中，Southern Blot分析确定了3株阳性重组子克隆。 利用阳性ES细胞诞生了7只具有高度嵌合性的雄性嵌合体小鼠。因为ES细胞来自129/Sv小鼠，囊胚来自C57BL/6小鼠，故嵌合体小鼠毛色为黑色和棕色。将嵌合率高于80﹪的雄性嵌合体小鼠与野生型C57BL/6雌鼠杂交后，后代均为黑色，PCR检测无新霉素基因的存在，未产生应该为棕色的杂合体子代小鼠。 [结论] 基因敲除载体被成功构建，且可产生嵌合体小鼠，但是遗传性状无法传递给子代。需选择其他阳性ES细胞克隆重复进行显微注射，或者构建新的敲除载体，以克服遗传性状不能传递的缺陷。 [研究方法](1)利用基因克隆技术将一长1740bp的小鼠sla/lp基因片段克隆到荧光素酶报告载体一pGL3 basic vector。(2)将构建的质粒分别转化到HEK293，RAW264.7和Hepa1-6这三种不同的细胞系中进行荧光素酶实验。(3)荧光素酶实验证实该1740bp片段具有起始转录功能后，经系列5’端剪切和3’端剪切定位核心启动子位置。(4)利用计算机软件预测可能存在的转录因子结合位点，检测对这些位点进行点突变后各克隆荧光素酶活性的变化，从而初步确定这些转录因子结合位点是否存在及其作用。(5)利用凝胶迁移实验(EMSA)和超凝胶迁移实验(Super shift)对转录因子结合位点加以确认。 [结果](1)1740bp小鼠sla/lp基因片段位于转录起始点上游并含盖转录起始点(-1623～+117)。荧光素酶实验证实其具有启动子活性并且活性具有方向性，表达在三种细胞中无差异。(2)经过系列剪切后，具有起始转录功能的最短片段定位于-99～-37，一个长63bp片段内。(3)该63bp片段不存在典型的核心启动子元件，如TATA盒，起始子(Inr)，下游启动子元件(DPE)和TFIIB识别元件(BRE)。(4)CpGProD和Alibaba2.1软件预测，sla/lp基因启动子很可能是CpG岛型启动子，并预测在63bp片段内存在两个Spl结合位点(-85～-76和．55～-41)，一个RAPl结合位点(-71～-62)。在63bp片段上游存在一个Oct-1结合位点(-184～-175)。(5)63bp片段内的两个Spl结合位点及RAPl结合位点分别经过点突变后，所产生的克隆几乎完全丧失起始转录的功能；而Oct-1结合位点的点突变克隆则可以在不同的细胞系中提高转录能力2.8到6.3倍。(6)这4个转录因子结合位点的凝胶迁移实验均出现了滞后带；其中，Spl(-85～-76)和Oct-1(-184～-176)的Super shift实验出现超滞后带，证实了这两个位点的存在；而Spl(-55～-41)和RAPl(-71～-62)结合位点未出现超滞后带，故尚不能确定它们一定存在。 [结论](1)sla/lp基因的启动子为CpG岛型启动子，核心启动子位于一个长63bp的片段内，位于转录起始点上游-99～-37的位置，不含有典型的核心启动子元件，内含一个转录活化因子spl、一个spl样和一个可能的RAPl结合位点。其上游含有转录抑制因子Oct-1结合位点。(2)SLA/LP蛋白在体内正常的广泛表达是转录活化因子Spl，RAPl和转录抑制因子Oct-1作用之间动态平衡的结果。(3)导致该平衡失衡的因素可能是AIH病人产生抗-SLA/LP抗体的基础。 [总结]在建立sla/lp基因敲除鼠模型过程中，成功的构建了基因敲除载体，并顺利地诞生了嵌合体小鼠，但改变后的基因未能成功地传递给子代获得杂合体小鼠，这里面含有许多经验教训，在今后的工作中，许多方面需要给予更多的关注。在ES细胞的培养过程中，要尽量避免或降低各种可能引起分化因素的作用，以最大程度提高遗传性状的可传递性。 Sla/lp基因的启动子为CpG岛型启动子，核心启动子位于一长63bp片段内，缺乏典型核心启动子元件，如TATA box，Inr，DPE，BRE等；转录因子Spl是sla/lp基因的转录活化因子， Oct-1为转录抑制因子，同时还可能存在转录活化因子RAPl的结合位点，为一多调节因子型启动子，同时也提示了sla/lp基因表达调控的复杂性。SLA/LP蛋白在体内的正常表达应该是Spl/RAPl和Oct-1作用动态平衡的结果；引起该平衡失衡的因素可能是导致SLA/LP在AIH中产生自身免疫性的原因之一，因此，进一步寻找这些因素将会是非常有意义的工作。 目前找到的调控sla/lp表达的转录因子，无论是活化因子还是抑制因子，均是在体内广泛表达的、无组织特异性的因子，这从一个侧面说明了为什么SLA/LP在体内各组织中广泛表达，而不具有组织特异性。这些转录因子的浓度和活性可能是控制sLA/LP蛋白在各组织中表达量不同的因素之一。同时，这种表达特点也带给我们这样一个问题，即在体内广泛表达的SLA/LP，为什么在AIH中只影响到肝脏，而不影响其他组织器官呢?是因为SLA/LP在AIH病人肝脏中的异常表达造成的吗?但我们的另一个实验结果显示SLA/LP在AIH、其他肝脏疾病以及健康对照之间的表达没有明显差异。一个可能的解释是，SLA/LP在肝脏发生的某种修饰作用导致了肝脏特异性、病理性的免疫损伤。的确，硒主要在肝脏代谢，并以硒蛋白的形式运输到其他的组织器官。在此过程中，受某种因素影响后，可能形成了一种具有抗原性的核糖核蛋白复合例，诱导了针对sLA/LP蛋白的病理性自身免疫反应。当然，这需要后续实验加以证实。