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背景前列腺癌是泌尿外科常见的肿瘤,随着医学界对这一疾病的认识不断深入,针对前列腺癌的治疗手段亦趋于多样化,但是对于去势抵抗性前列腺癌(CRPC)仍缺乏有效治疗手段。近年来,针对CRPC的基因治疗逐渐成为研究热点,而其中寻找到能够发挥抗前列腺癌效应基因靶点显得尤为重要。葡萄糖调节蛋白78KD (GRP78)是一种在肿瘤细胞生存和进展过程中发挥重要作用的蛋白,近年的研究发现下调多种类型肿瘤细胞中的GRP78表达可发挥抗肿瘤效应。然而,目前尚缺少通过下调GRP78观察其能否在前列腺癌中发挥抗肿瘤效应的研究。此外,近期的部分研究表明非对称小干扰RNA (asiRNA)可比传统的对称性小干扰RNA更加有效且持久的下调靶基因的表达。因此在本研究中,我们针对GRP78的mRNA序列设计了一系列的非对称小干扰RNA,以观察其对前列腺癌细胞生物学行为的效应。方法通过RT-PCR和Western Blotting方法评估了三种不同的前列腺细胞系中GRP78的表达水平；针对GRP78的mRNA序列设计并合成了一系列非对称小干扰RNA；通过流式细胞术筛选合适的转染试剂和转染浓度；对去势抵抗性前列腺癌PC-3细胞进行转染后,观察非对称小干扰RNA下调细胞内GRP78表达的效应,并与对称性小干扰RNA进行比较；随后观察特异性下调GRP78对PC-3细胞生长率,凋亡及迁移的影响；通过检测caspase信号途径相关蛋白和细胞迁移相关蛋白探讨非对称小干扰RNA下调细胞内GRP78抗前列腺癌效应的可能机制。结果相对于传统的对称性小干扰RNA,针对GRP78mRNA设计的15bp非对称小干扰RNA (asiGRP78-3)表现出了更强的下调PC-3细胞GRP78表达水平的效应。通过asiGRP78-3下调GRP78在PC-3中的表达,可抑制PC-3细胞生长率,诱导其凋亡并抑制其迁移能力。进一步研究表明,GRP78下调抑制了PC-3细胞的AKT磷酸化并下调pro-caspase9和pro-caspase3表达,可能是asiGRP78-3促进PC-3细胞凋亡的机制；下调GRP78的同时PC-3细胞中波形蛋白(vimentin)的表达也下调,这可能是asiGRP78-3抑制PC-3迁移的机制。结论相比于对称性小分子干扰RNA,非对称小干扰RNA可更有效的下调前列腺癌细胞内GRP78表达水平。非对称小干扰RNA下调GRP78表达后可抑制前列腺癌细胞的增殖,诱导其凋亡并抑制其迁移,因此GRP78具有作为去势抵抗性前列腺癌的基因治疗靶点的价值,而非对称小干扰RNA在下调前列腺癌GRP78表达方面具有一定的应用价值。背景前列腺癌已成为泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。虽然目前针对前列腺癌的治疗手段非常多样,但去势抵抗性前列腺癌(CRPC)仍然是前列腺癌的治疗难点,因此针对CRPC的基因治疗逐渐成为治疗热点。Kruppel样因子4(KLF4)是细胞内一类重要的转录因子,其表达下调可促进肿瘤增殖和迁移。近年的研究显示,小RNA不仅可以下调细胞内特定基因表达,也可以特异性上调某些基因表达。与人工合成的双链小RNA相比,通过质粒载体表达的短发卡小、RNA(shRNA)作用持续性更佳且可以与靶向分子等材料偶联。本研究拟针对KLF4启动子中特定序列设计重组质粒pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表达载体,并将其导入前列腺癌细胞PC-3中,观察其上调KLF4表达的效应,并检测其对前列腺癌细胞肿瘤生物学行为的影响。方法本研究根据shRNA设计原则,针对KLF4启动子-496序列设计并人工合成saKLF4-496激活序列,使用T4DNA ligase连接酶将合成后的saKLF4-496连接入重组载体pENTR/CMV-EGFP-U6构建重组质粒pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表达载体；重组质粒经扩增、提取后测序鉴定；使用阳离子聚合物将pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496转染入PC-3细胞,优化转染效率后,以RT-PCR方法和Western Blotting方法检测PC-3细胞内KLF4表达情况；采用transwell方法,检测转染了pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496的PC-3细胞迁移能力的变化。结果成功构建的针对KLF4启动子-496序列设计的重组质粒pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表达载体；转染此载体后96小时,RT-PCR检测到PC-3细胞内KLF4mRNA表达上调,转染后96小时Western Blotting检测到PC-3细胞内KLF4蛋白表达上调；Transwell检测表明,转染pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496载体的PC-3细胞迁移能力较对照组下调。结论可成功构建pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表达载体,此表达载体可上调前列腺癌细胞内KLF4mRNA和蛋白水平；转染pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表达载体后可前列腺癌细胞的迁移能力。