梅叶冬青对糖尿病创伤保护体内外活性初步研究

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目的:  1观察梅叶冬青提取物对HUVEC细胞增殖以及迁移作用。  2检测梅叶冬青提取物抗高糖诱导的细胞凋亡作用。  3初步观察梅叶冬青软膏剂对大鼠糖尿病创面溃疡愈合效果。  4通过病理切片HE染色以及胶原三色染色验证梅叶冬青提取物对创面肉芽组织及胶原生成情况。  5通过免疫组化CD31,CD68和TGF-β1验证梅叶冬青提取物对组织炎症细胞浸润及诱导新生血管生成的作用。  方法:  1给予HUVEC细胞梯度浓度的梅叶冬青提取物处理后,以MTT法测定各组HUVEC细胞增殖率,通过经典细胞划痕实验检测梅叶冬青对细胞迁移的作用。  2将HUVECs分别在生理浓度葡萄糖NG(5mmol/L)和高糖HG(30mmol/L)条件下培养后Hoechest33258染色后荧光染色法,定性观察细胞核形态变化,AnnexinⅤ-FITC/PI双染结合流式细胞仪定量检测抗高糖诱导凋亡。  3通过采用腹腔注射STZ(链脲佐菌素)诱导SD雄性大鼠Ⅰ型糖尿病造模。将大鼠随机分为正常组和糖尿病组。糖尿病组又随机分为5%给药组、10%给药组、阴性对照组和莫匹罗星阳性对照组,通过比较造糖模组与正常组体重与血糖值的差别来验证造模成功与否。后剪去大鼠背脊两侧直径1.8cm的圆形全层皮肤造局部溃疡模型。  4在糖尿病溃疡模型的基础上给予相应给药处理,之后于第7天,第14天,第21天定期对创面进行拍照并比较各组溃疡愈合率差异。  5在Ⅰ型糖尿病溃疡造模成功后各组相应给药的基础上,以CD31抗体特异性显示血管内皮细胞观察微血管阳性表达的改变,并通过对生物分子CD68,Masson胶原的阳性表达试图解释梅叶冬青对糖尿病溃疡提高细胞增殖能力而形成肉芽组织,促进胶原蛋白重塑,诱导血管生成增殖分化的作用机制。  结果:  1在细胞活性检测MTT实验和细胞划痕迁移实验中,增殖率以及细胞迁移率结果显示在25μg/mL-100μg/mL剂量范围内梅叶冬青对HUVECs有增殖效应及促细胞迁移作用,与细胞对照组相比有显著差异(P<0.05),且在剂量范围内随着药物浓度增加,量效关系较为显著。  2抗凋亡相关实验中,Hoechest33258染色显示梅叶冬青提取物可明显抑制高糖诱导的细胞形态变化;亦可减少凋亡引发的细胞核碎裂;AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式细胞仪定量检测阴性对照组细胞早期及中晚期细胞凋亡率显著升高,而给予梯度浓度梅叶冬青提取物处理后凋亡率相应减少(P<0.05)。  3梅叶冬青软膏高低剂量治疗组的创面愈合明显比空白对照组快(P<0.05),且高剂量组创面愈合较低剂量愈合更佳。  4病理切片HE染色及免疫组化染色的结果表明4个组中10%梅叶冬青软膏给药组在促进创面愈合,加快胶原合成,增加内皮细胞黏附分子(CD31)的阳性表达,上调转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白阳性表达上效果最好。  结论:  1梅叶冬青对体外人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖、迁移及高糖诱导内皮细胞损伤具有保护作用,其可能成为一种新的促进糖尿病溃疡愈合药物。  2整体动物实验证明梅叶冬青软膏可促进糖尿病溃疡的愈合,其机制可能是通过促进新生血管生成及胶原蛋白的合成作用。为临床局部给药治疗糖尿病性溃疡提供实验参考。
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