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细胞自噬（Autophagy）是真核细胞物质降解及重利用的重要途径,在维持细胞稳态、提高细胞逆境存活率方面发挥着重要作用。酵母细胞自噬过程可分为自噬前体组装位点（Phagophore assembly site,PAS）的形成、自噬前体（Phagophore）的延伸、自噬前体的闭合、自噬体（Autophagosome）与液泡的融合和自噬小体（Autophagic body）的降解五个阶段,这其中的诸多分子机制尚不明确。本实验室近几年着重于自噬前体闭合调控因子及机制的研究,发现在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中,调控细胞内囊泡运输的Rab蛋白Vps21与作用于多囊泡体（Multivesicular bodies）形成的转运必需内体分选复合物（Endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）协作,参与自噬前体的封口。Vps21以及ESCRT主要亚基Snf7和Vps4的缺失导致自噬前体闭合受阻,使得未闭合自噬体在液泡外成簇堆积,但堆积比例的高低受菌株培养条件等影响,不排除部分未闭合自噬体进入了液泡。本研究检测了产未闭合自噬体酵母菌株的耐氮饥饿能力,并重点探讨了特殊条件下未闭合自噬体是否与液泡融合进入了液泡。主要研究结果如下:1.产未闭合自噬体酵母菌株的耐氮饥饿能力下降氮饥饿处理产未闭合自噬体的酵母自噬缺陷菌株vps21Δ、snf7Δ和vps4Δ,并利用台盼蓝染色法和生长培养法跟踪检测细胞存活率,发现这些菌株耐氮饥饿能力下降。而在vps21Δ、snf7Δ和vps4Δ菌株中过表达对应蛋白Vps21、Snf7和Vps4时,菌株耐氮饥饿能力得到提升,与之前实验室发现过表达对应蛋白使自噬缺陷得到回补的结果一致。2.未闭合自噬体降解程度与细胞生长密度、氮饥饿时间和液泡蛋白水解酶表达量有关本实验室以往研究发现,相比于细胞指数生长期,在细胞生长密度很高（OD600>3）时进行氮饥饿处理,产未闭合自噬体酵母菌株的自噬体堆积比例显著减小。以Vps21缺失菌株为例,设置细胞生长密度梯度（OD600=0.5,1,2,3,4）,发现随着细胞生长密度的升高,氮饥饿处理后未闭合自噬体的降解量显著增加。自噬完全阻断的atg1Δ菌株中无自噬体产生且GFP-Atg8的降解基本不受菌液密度和氮饥饿时间的影响。由于酿酒酵母中液泡蛋白水解酶的含量随着细胞生长密度的升高而增加,如果高密度的液泡蛋白水解酶含量可以增加未闭合自噬体进液泡,那么延长氮饥饿时间促进液泡蛋白水解酶含量增加的情况下,应该也能观察到产未闭合自噬体酵母菌株中自噬体的降解程度随氮饥饿时间增加而增加。本文以Vps4缺失菌株为例,设置氮饥饿处理时间梯度（5 min,30min,2h,4h,6h,12h,24 h）,发现随着氮饥饿处理时间的延长,未闭合自噬体降解量确实显著增加。如果确实是酿酒酵母中液泡蛋白水解酶的含量升高使未闭合自噬体的降解量增加,那么在产未闭合自噬体酵母菌株vps21Δ、snf7Δ和vps4Δ中敲除液泡蛋白水解酶基因及过表达液泡蛋白水解酶,则会使缺氮条件下未闭合自噬体的降解量相应地减少和增加。本文结果确实发现液泡蛋白水解酶的缺失促进了未闭合自噬体在液泡外的堆积,其过量表达则促进了未闭合自噬体的降解。总而言之,提高细胞培养密度、延长氮饥饿时间及增加液泡蛋白水解酶表达量均可促进产未闭合自噬体酵母菌株中自噬体进入液泡降解,而缺失液泡蛋白水解酶后未闭合自噬体在液泡外堆积增加,自噬体降解减少,说明液泡蛋白水解酶可调控未闭合自噬体在液泡外的堆积及进入液泡过程。3.长时间氮饥饿可促使未闭合自噬体与液泡融合进入液泡降解在产未闭合自噬体酵母菌株中,未闭合自噬体是与液泡融合进入液泡降解,还是先封口形成成熟自噬体进而与液泡融合?为了回答这一问题,则需要创造促使产未闭合自噬体酵母菌株中自噬体大量进入液泡且使进入液泡的自噬体不被降解的条件。基于上述实验结果,可采用延长氮饥饿时间和去除液泡蛋白水解酶的方式实现。采用了敲除其液泡蛋白水解酶基因PEP4和PRB1,控制细胞生长OD600=1,并氮饥饿处理2-8 h的条件。通过自噬体分离技术结合蛋白酶保护实验分别检测了积聚在液泡膜外（氮饥饿处理2 h）和液泡膜内（氮饥饿处理8 h）中自噬体状膜结构的闭合特性,发现液泡膜外的未闭合自噬体进入液泡后仍未闭合,即未闭合自噬体以一种未知的方式与液泡融合进入了液泡。此外,在酵母细胞自噬中,未闭合自噬前体经历封口形成闭合自噬体的过程伴随着一些自噬相关（Autophagy-related proteins,Atg）蛋白脱落至胞质,这些Atg蛋白包括Atg11,而这些Atg蛋白仍停留在未封口的自噬体上。通过激光共聚焦荧光显微镜检测到vps21Δ菌株的未闭合自噬体上的Atg11也进入液泡,且与液泡中自噬体状膜结构共定位,从另一方面佐证了未闭合自噬体可与液泡融合进入液泡这一结论。不同于细胞自噬研究领域中以往认为“自噬前体只有经过封口过程成熟为自噬体才能与液泡融合并降解”的传统观点,本文通过实验提出了未闭合自噬体可以与液泡融合,进入液泡降解的新观点,虽然未闭合自噬体与液泡融合进入液泡降解的具体分子机制及生理意义仍待继续研究。