腺相关病毒(adeno－associated virus,AAV)属于微小病毒科,病毒基因组DNA为单链线形分子,其两端各有一段结构完全相同的反向末端重复序列(inverted terminal repeats,ITRs)。ITRs之间为两个开放式阅读框架，含有Rep基因与Cap基因。目前鉴定的AAV血清型超过100种，常用的为AAV1-9型。肿瘤治疗的传统方法主要为放疗、化疗、手术切除等，现在又产生了病毒治疗、基因治疗以及联合病毒-基因治疗，目前这些治疗方式都集中了大批科学家在为之努力。传统治疗手法（除了手术切除）都存在靶向性问题，而病毒治疗、基因治疗以及联合病毒-基因治疗目前其靶向性也不能令人满意。Shuffling技术为解决靶向性问题提供了一个坚实的技术基础。它既可以使基因序列发生点突变，也可以使基因片段发生插入、缺失、倒转和整合等，并且可以进行反复改组，使突变效应不断叠加，这是其他的突变技术所无法实现的巨大优势。由于AAV的靶向性是由其Cap基因编码的Cap蛋白所决定的，而通过对Cap基因进行shuffling，可以得到多种多样的各种嵌合型的Cap基因，其编码的蛋白也就会各不相同，从而使其靶向性多样化。因此，从shuffling所得到的AAV Cap基因库中就可能筛选出高效靶向某种特定细胞的Cap基因型。目前在所鉴定出的所有AAV血清型中，以对AAV2研究的最为透彻，其生物学特性也最为清楚，因此用其Rep作为重组AAV载体的通用Rep，其安全性也最高。基于这些原理，本课题所做的的主要研究过程为：(1)通过一系列的载体构建，最终构建出以pAAV-MCS载体为基本骨架载体，含AAV2ITR和Rep2序列的pAdB载体。同时用DNaseI对AAV1-9的Cap基因随机切断，切成大小在100-300bp之间的片段，然后对其进行合拉，使片段随机组合成嵌合的Cap序列。然后再以pAdB载体为基本骨架，将其与合拉的嵌合Cap序列进行连接，构建出pARC载体，重复这一过程，不断构建含有嵌合Cap序列的pARC载体库。(2)用pARC载体包装嵌合AAV病毒并进行筛选：用pARC质粒转染HEK293细胞，并加入5型腺病毒（Ad5），使AAV完成复制表达过程，最终包装出嵌合AAV病毒。接着将包装出的嵌合AAV病毒与Ad5共感染BEL7402肝癌细胞，经过三轮筛选感染后，初步筛选出可以靶向肝癌细胞的嵌合AAV(cAAV)。(3)检测筛选到嵌合AAV病毒的靶向性感染效率。首先将筛选出的AAV Rep2-嵌合Cap基因连接到pMD18-T载体上，构建出pARC-T载体，然后与AAV-EGFP质粒共转染293细胞，并加入Ad5，包装出里面包有EGFP基因、外面包被嵌合Cap外壳的AAV病毒（cAAV-EGFP），最后用cAAV-EGFP感染BEL7402细胞，观察绿荧光的表达。最终观察到绿荧光表达，证明筛选出了对BEL7402肝癌细胞具有一定靶向性的嵌合AAV。测序结果表明，本嵌合AAV的Cap序列是由AAV2，AAV7和AAV8三种AAV的Cap嵌合而成。本研究证明了此方法和技术的可行性，为进一步扩大嵌合AAV库容量和深入的研究做出了有益的探索。