骨髓中存在一定数量的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），能够通过分化形成多种中胚层组织。由于MSCs具有吸附塑料表面的特性以及特异的表面标志（高表达CD166、CD29、CD13、CD105，不表达CD34、CD45、HLADR），因此可以从骨髓中分离出来并通过流式细胞技术加以鉴定。 研究证明MSCs可为骨、软骨、肌腱、心肌等组织的修复和重建提供细胞来源，并且可以支持体内造血、诱导T细胞对抗原的低反应性、降低异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease，GVHD）的发生率和严重程度，但其免疫调控的机制尚不清楚。人骨髓中的MSCs含量极少，10⁴-10⁵个骨髓单个核细胞中仅含1个MSC，难以满足组织工程和自体或异体移植的需要。因此，体外扩增MSCs并研究其生物学特性尤为重要。本实验采用Percoll（1.073g／ml）密度梯度离心法分离出骨髓单个核细胞，将之接种于含10％FBS的LG-DMEM培养基中，利用MSCs黏附于塑料表面的特性，获得纯化的MSCs。采用本方法细胞贴壁快，易纯化，P3代细胞的均一性达到98％以上，原代培养和传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCs有活跃的增殖能力，来源于骨髓5×10⁶个单个核细胞（Mononuclear cell，MNC）的MSCs，经体外培养扩增P0、P5、P10代细胞数分别为10⁶、10⁸、10¹⁰个，原代细胞潜伏期长，P10代以后的细胞生长速度变缓慢，出现衰老征象。实验结果为临床应用MSCs提供了参考依据。 本实验同时定时、定量研究了MSCs对异基因T淋巴细胞表型的影响，以经CO⁶⁰照射后的不同数量的MSC作为基底层细胞，接种体外分离纯化的相同数量的异体T淋巴细胞，分别于0小时、24小时、72小时、7天后用流式细胞技术测定各组T细胞表型的变化并计数各组T细胞数。结果显示，当T细胞数与MSC数 4中文摘要一比例为25:1（A组）、50:1（B组）时，CD4‘CD25‘细胞与对照组相比均明显增加（A组P=0.0023，B组P=0.0031），CDS‘细胞明显增多（A组P=0.0106，B组P=0 .0148），两者均随着共培养时间的延长而表达量逐渐增加，A组和B组之间无明显差别（P=0.2350），实验组（A组和B组）与对照组相比，CD3+、CD4‘、CD25+细胞无明显差别;当T细胞数与MSC数比例为100:1（C组）时，与对照组相比，CD4表达略上调，但无统计学意义，CD3‘、CDS‘、CD25‘、CD4‘CD25‘细胞无明显差别。随培养时间的延长，与MSC共孵育组和单独T淋巴细胞培养组中T淋巴细胞的数量均呈下降趋势，在第7天时T细胞单独培养组细胞数减少约21.5%，与MSC共孵育组T淋巴细胞数:A组减少65.00rk以上，B组减少60.00k，C组减少12.5%。以上结果提示，MSCs与T淋巴细胞共培养时，当加入的MSCS达到一定的数量时（T细胞:MSC毛50:l）可以引起T淋巴细胞的表型发生改变，表现为CD4℃D25十细胞和CDS+细胞明显增多，并且抑制T淋巴细胞的增殖;而当加入的MSCS小于一定的数量时（T细胞:MSC〕100:1），T淋巴细胞的表型无明显改变，并且刺激T淋巴细胞增殖。表明MSC的负调控机制可能与诱导CD4℃D25+免疫调节性T细胞以及CDS+T细胞增多有关，同时也表明MSC对T淋巴细胞的作用与MSC的数量有关。 实验结果为防治异基因造血干细胞移植中GVHD和VGHR的发生、诱导免疫耐受提出了一条新的思路，为临床异基因造血干细胞移植时输注MSCS预防GVHD的MSCS输注数量提供了参考依据。