阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是主要发生在老年人的一种神经退行性综合征。AD的主要病理改变是老年斑(senile plaques，SP)，神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)及神经元丢失和突触丧失。在AD病理过程的早期阶段，可溶性Aβ寡聚物介导的NMDA受体的内化作用可能引起突触功能受损。Aβ诱导突触功能缺失的机制研究仍处于初期阶段，其中包含许多细胞内的信号转导通路。纹状体富集的酪氨酸磷酸酶（Striatal-enriched phosphatase，STEP）调控NMDA受体的内化。以STEP为切入点，解析AD发病机制并寻找AD治疗靶点已经成为AD治疗学的热点之一。　　 STEP是一种酪氨酸磷酸酶，STEP mRNA交替剪接产生了4种亚型。STEP46和STEP61包括蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的催化区域，然而STEP38和STEP20两种亚型没有该区域。STEP46是胞质内蛋白，而STEP61是膜结合蛋白，但不是跨膜蛋白。与前者不同的是STEP61的N端有172个氨基酸，N端的序列靶向到胞内细胞器，内质网(ER)和后突触密度(PSD)，STEP61与后突触密度和NMDA受体复合物结合。这个区域包括两个转膜区(TM)，两个多聚脯氨酸富集区域和两个PEST序列。第一个脯氨酸区域与Fyn相互作用，而PEST序列是蛋白裂解的位点。STEP46和STEP61C末端都有280个氨基酸区域，包括一个催化位点，有着一致的序列[I/V]HCxAGxxR[S/T]G。紧挨N末端是激酶相互作用模序(KIM)，该模序对于STEP,HePTP和PTP-SL是唯一的，并且是MAPK家族成员ERK的结合位点。STEP61在KIM区域有两个丝氨酸残基，能够被PKA(S)磷酸化，然而STEP46只包括一个丝氨酸残基。在KIM区域磷酸化阻止了STEP与ERK结合，并且导致磷酸酶失活。在体和离体研究表明STEP的活性在一般状态下很低，一旦激活，STEP能结合并下调其底物ERKs等的活性;先前的研究还表明STEP61能结合NMDA受体复合物，降低该受体的活性，干扰长时程增强(LTP)的诱导，并且是通过STEP脱磷酸化调控的酪氨酸位点(Tyr1472)的NMDA受体2B亚单位(GluN2B)而实现的，从而导致了GluN1/GluN2B受体复合物的内化。　　 近年来有关STEP与神经退行性疾病发病机理的研究逐渐引人关注，通过对AD患者和Tg2576小鼠的研究表明，STEP61在大脑皮质的表达显著增强;而基因敲除STEP61的3xTg-AD小鼠在不改变Aβ和Tau蛋白沉积的情况下逆转了3xTg-AD小鼠的认知功能障碍，谷氨酸受体（AMPA和NMDA受体）的细胞膜表面表达也增加了，ERK1/2和Fyn在基因敲除小鼠中表达上调。令人感兴趣的是在小鼠脑内STEP61蛋白表达呈年龄性增高趋势;Aβ也能促使STEP61在脑内表达上调，这两种情况均是诱发AD的重要危险因素。然而，有关STEP61与AD发病机理的研究尚不全面。　　 本研究对STEP61在野生型小鼠和Tg-APPswe/PSEN1dE9(APP/PS1)转基因小鼠脑内的定位分布、表达变化及在AD细胞模型（Aβ1-42处理的皮质神经元细胞）中进行系统分析，应用RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）使STEP61基因沉默，从STEP61的活性调控角度，探讨STEP61活性调控ERK信号通路和NMDA受体运输的作用，对深入探讨脑酪氨酸磷酸酶STEP61参与AD的病理生理机制具有重要意义。　　 实验方法　　 采用双转染人APP695swe基因和人早老素（presenilin, PS-1）突变基因的AD模型小鼠Tg-APPswe/PSEN1dE9(APP/PS1)及外源性加入Aβ1-42的皮质神经元细胞为研究对象，应用免疫组化和免疫荧光技术检测STEP61在APP/PS1小鼠脑内的定位分布及其与NMDA受体2B亚单位(GluN2B)在大脑皮质内的位置关系，应用Western Blot技术检测野生型小鼠和APP/PS1小鼠脑皮质突触小体内STEP61的蛋白表达随年龄增长的变化，进一步检测12月龄APP/PS1小鼠大脑皮层和海马部位突触小体及加入Aβ1-42的皮质神经元细胞中STEP61的蛋白表达变化，应用RNAi技术阻抑STEP61基因在外源性加入Aβ1-42的皮质神经元细胞的表达，并应用MTT技术、Western Blot技术和real-time RT-PCR技术检测RNAi对STEP61的基因沉默效果，应用Western Blot技术检测STEP61-RNAi对ERK/CREB信号通路和NMDAR转运的影响。　　 实验结果　　 一、STEP61异常分布和表达参与AD发生的在体研究　　 （一）STEP61在不同月龄野生型小鼠和APP/PS1转基因小鼠大脑皮质中的蛋白表达和活性分析　　 我们检测了3、6、9、12、15和18月龄的野生型小鼠和同龄APP/PS1小鼠大脑皮质突触小体中STEP61蛋白表达水平和磷酸化STEP61的比例（磷酸化STEP61/总STEP61），结果表明STEP61蛋白表达水平和脱磷酸化比例（STEP61活化形式）随年龄增长明显增加，即与年龄呈正相关。APP/PS1转基因小鼠大脑皮质中的蛋白表达和活性形式较同龄野生型小鼠明显增加，差异具有统计学意义。　　 （二）12月龄APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力缺损　　 在定位航行实验中，APP/PS1转基因小鼠寻找平台的潜伏期明显增加，与同龄野生型小鼠相比较有显著性差异，结果表明APP转基因小鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力明显受损。　　 在空间探索实验中APP转基因小鼠花费在目标象限的时间明显减少，与同龄野生型小鼠相比较有显著性差异，结果表明APP转基因小鼠对水迷宫空间认知和记忆能力明显受损。　　 （三）STEP61在12月龄APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马内的分布和表达　　 1、应用STEP61和GluN2B免疫荧光双标技术，验证STEP61与GluN2B在APP/PS1转基因小鼠脑皮质中具有共位性。　　 2、普通免疫组化染色，检测了STEP61在APP/PS1转基因小鼠脑内的分布。APP/PS1小鼠大脑皮层和海马CA1区内均可见STEP61阳性分布。STEP61表达在神经元的细胞膜和突起上，而在细胞体的免疫反应相对较少。12月龄APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马内STEP61的阳性表达与同龄野生型小鼠相比较显著增加，STEP61 HSCOREs APP/PS1组与野生型组相比明显增加，差异具有统计学意义。　　 3、利用Western Blot检测方法分别对12月龄APP/PS1转基因小鼠大脑皮层和海马突触小体内STEP61，pERK1/2，pGluN2B蛋白表达水平进行分析。　　 本实验结果显示，STEP61在APP/PS1转基因小鼠脑内蛋白表达和活性增加;而pERK1/2，pGluN2B蛋白表达减少。　　 一、STEP61参与AD发生的离体研究和STEP61影响AD突触功能变化上的机制研究　　 （一）STEP61在外源性加入Aβ1-42的皮质神经元细胞中的表达和活性变化　　 1、Western Blot结果显示，外源性加入Aβ1-42有助于STEP61在皮质神经元细胞中的蛋白表达和脱磷酸化比例增加，而外源性加入Aβ42-1对于STEP61在皮质神经元细胞中的蛋白表达和脱磷酸化比例无影响。　　 2、α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7AchRs）介导Aβ-诱导的STEP61蛋白水平和活性的增加　　 Aβ1-42处理前30分钟预先给予α7AchRs拮抗剂α-bungarotoxin(BTX;10μM)抑制了STEP61蛋白水平和活化的增加。　　 3、NMDA受体介导Aβ-诱导的STEP61蛋白水平和活性的增加　　 在皮质神经元细胞中加入Aβ1-42诱导STEP61蛋白水平和其脱磷酸化比例（其活性形式）的增加，预先加入NMDA受体拮抗剂(AP5)抑制了上述过程。　　 4、RNA干扰STEP61基因沉默效果检测　　 Western Blot和Real-time RT-PCR结果显示，转染STEP siRNA组可明显抑制STEP61蛋白表达和基因表达，干扰后48 h为抑制效果最佳时间点（瞬转）。　　 5、STEP61在Aβ1-42处理的皮质神经元细胞中对ERK/CREB信号通路的调控作用　　 本实验结果显示细胞在谷氨酸刺激5-15分钟诱导细胞兴奋毒性，STEP61结合并下调ERK。更重要的是我们首次提出在AD细胞模型中，ERK1/2和CREB的磷酸化表达较空白对照组明显减少，而基因沉默STEP61后ERK1/2和CREB的磷酸化水平明显增加。　　 6、STEP61在Aβ1-42处理的皮质神经元细胞中对NMDA受体运输的调控作用　　 Tyr1472位点的NMDA受体2B(GluN2B)的磷酸化在Aβ1-42-处理的皮质神经元细胞中表达降低，而STEP61基因沉默后使GluN2B(Tyr1472)的磷酸化水平增加。　　 结论：　　 1、STEP61蛋白表达和活性的增加在野生型鼠和AD模型鼠脑皮质中具有年龄依赖性，在APP/PS1转基因小鼠大脑皮层的表达和活化形式均高于野生型小鼠。　　 2、STEP61在老年APP/PS1转基因鼠脑内表达和活性增强与认知功能缺损可能密切相关。　　 3、STEP61与GluN2B在APP/PS1转基因小鼠脑皮质中具有共位性。APP/PS1小鼠大脑皮层和海马CA1区内均可见STEP61阳性分布。12月龄APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马内STEP61的阳性表达与同龄野生型小鼠相比较显著增加，STEP61 HSCOREs AD组较WT组明显增加，差异具有统计学意义。APP/PS1转基因小鼠大脑皮层和海马突触小体内STEP61蛋白表达和脱磷酸化比例较野生型鼠明显增加;而pERK1/2，pGluN2B蛋白表达明显减少。　　 4、外源性加入Aβ1-42有助于STEP61在皮质神经元细胞中的蛋白表达和活化形式增加。α7AchRs和NMDA受体均是Aβ-诱导STEP61蛋白水平和活性形式增加过程中必不可少的因素。　　 5、STEP61调控ERK的活性，影响ERK活化的时间;STEP61提供了一个反馈机制限制ERK活化的时程。在AD细胞模型中STEP61-RNAi可明显增加ERK信号通路pERK1/2，pCREB的蛋白表达，提示STEP61可能参与了调控Aβ-介导的ERK/CREB信号通路。　　 6、STEP61调控NMDAR2B亚单位(GluN2B)在Tyr1472位点的磷酸化蛋白表达。在AD细胞模型中STEP61-RNAi可明显增加pGluN2B的蛋白表达，提示STEP61可能参与了调控Aβ-介导的NMDA受体运输。