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中国卤虫(Artemiasinica)是一种广温、耐高盐的小型甲壳动物。广泛分布于沿海盐池和内陆盐湖中,有较强的抗逆能力。在恶劣外界环境的条件下能产出休眠卵,其胚胎发育被阻滞。当环境条件适宜时,滞育解除,胚胎重新发育。 细胞分裂周期、凋亡调控蛋白Ⅰ(celldivision cycle and apoptosis regulator proteinⅠ,CCAR-1又称CARP-1)在细胞周期进程中发挥重要作用,与其他细胞周期调控蛋白复合,促进细胞凋亡。 在Wnt通路中,CCAR-1与β-catenin功能共激活,协助β-catenin在Wnt目标基因作用中的转录激活;CCAR-1与APC/C亚基APC-2结合,在CFM-4的激活下,阻碍细胞进入G2/M期,参与caspase泛素蛋白酶途径,导致cyclinB1蛋白缺失。CCAR-1通过与肿瘤抑制基因P53的结合,并作为P53的共激活剂,在转录调控的过程中起到作用,同时,其作为一种促凋亡信号,调控细胞周期;CCAR-1和p160共激活剂复合物,在核内作用于目标基因产生适当的激素。因此,CCAR-1在细胞周期调控过程中发挥重要作用,但其在中国卤虫滞育及滞育解除过程中的细胞周期调控的作用尚需进一步探究。 本研究采用RACE、基因组步移(Genome Walking kit)技术得到中国卤虫As-CCAR-1的部分cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。以Real-Time qPCR、原位杂交、免疫荧光等技术对CCAR-1在卤虫的不同发育时期、低温、高盐胁迫下的表达量、表达模式和表达部位进行了研究。 通过RACE技术获得As-CCAR-1基因片段序列,片段长1594bp,内包含1584bp的ORF序列,包含3个结构域:S1-Like、DBC1和SAP。信息学分析预测分子量为129kDa,理论等电点为4.99,为疏水性蛋白。亚细胞定位实验表明As-CCAR-1蛋白位于细胞质内,各细胞器均有所分布。Real-Time qPCR结果显示在胚胎滞育解除,发育的中后期具有最高的表达量(3d),低温和高盐胁迫下的表达显著降低。原位杂交实验结果显示As-CCAR-1基因在中国卤虫个体发育全阶段、各组织均有所表达。上述实验结果说明,As-CCAR-1基因与调控细胞周期及细胞凋亡有关,且广泛分布于卤虫体内。初步证明其参与了中国卤虫滞育解除过程中促进细胞凋亡的作用。 本研究旨在阐明CCAR-1基因在中国卤虫滞育解除及胚胎生长发育过程中的作用,对进一步开发利用卤虫资源有重要的的指导意义,对细胞周期,细胞凋亡的进一步研究提供一定的理论依据。