近些年,随着新一代测序技术的发展与普及,nanopore测序技术逐渐进入人们的视野,因其测序读长长、测序周期短、操作简单等优点,成为了众多研发工作人员的意向对象,因此,开发出测序读长更长、测序周期更短、操作更为便利的nanopore测序仪,成为了nanopore测序仪开发者急需解决的问题,但在追求测序读长更长、测序周期更短、操作更为简单等性能的前提下,如何保证nanopore测序仪的精密性也成了急需解决的问题,本文旨在验证nanopore测序仪的精密性,以及制备不同物种的nanopore测序文库,测试nanopore测序仪的应用性能,得到结果如下:通过载体质粒酶切、测试文库片段人工合成,制备线性化的载体和测试文库片段,线性化载体和测试文库片段通过一步克隆,制备双链测试文库片段制备质粒和单链测试文库片段制备质粒。以双链测试文库片段制备质粒为模板,经PCR扩增,在双链测试文库片段两端加上BsaI限制性内切酶位点及不同的粘性末端,PCR产物经纯化、BsaI限制性内切酶消化及纯化,制备足量的双链测试文库待连接片段,设计测序接头,测序接头与双链测试文库待连接片段连接,连接产物经胶回收,制备双链测试文库,为测序仪精确性验证制备了实验材料。将单链测试文库片段制备质粒转化至大肠杆菌JM109内,后者经过夜培养、分离培养上清、目的M13 phage单链基因组提取,获得含单链测试文库片段的目的M13phage单链基因组,目的M13 phage单链基因组与酶切互补片段退火,经EcoRI、XbaI限制性内切酶消化、磁珠纯化,制备单链测试文库待退火片段,设计测序接头,测序接头与单链测试文库待退火片段退火,制备单链测试文库,为测序仪精确性验证制备了实验材料。使用nanopore测序仪对已制备的双链测试文库、单链测试文库进行测序,比对双链测试文库、单链测试文库的nanopore测序结果与双链测试文库、单链测试文库的核酸序列信息,验证了nanopore测序仪对双链测试文库、单链测试文库测序的精确性,结果表明:nanopore测序仪对双链测试文库片段测序的准确率为95.0%,nanopore测序仪对单链测试文库片段测序的准确率为86.3%。在验证nanopore测序仪的精密性基础上,使用nanopore测序仪分别对人、小鼠的SCFV-Fc轻链基因进行测序分析,探究nanopore测序仪的实际应用价值,得到结果如下:人、小鼠的SCFV-Fc轻链基因5端经EcoRI限制性内切酶消化、3端经HindIII限制性内切酶消化,纯化产物建库;比对人、小鼠的SCFV-Fc轻链基因酶切文库的nanopore测序结果与人、小鼠的SCFV-Fc轻链基因酶切文库的序列信息,得出nanopore测序仪在实际应用上的精确性,nanopore测序仪对人的SCFV-Fc轻链基因酶切文库片段测序的准确率为95.4%,nanopore测序仪对小鼠的SCFV-Fc轻链基因酶切文库片段测序的准确率为95.6%;综合上述实验结果,nanopore测序还存在一定的误差率,nanopore测序仪还有待进一步改进提高。