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【研究背景】增生性瘢痕是皮肤组织损伤后，创面愈合中过度纤维化的产物。肌成纤维细胞由成纤维细胞经表型转化而来，是导致增生性瘢痕形成的主要效应细胞。研究表明，TGF-β1是诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化的关键刺激因素。TGF-β1除由经典的Smad分子介导其下游信号传导外，还与Wnt信号通路存在交互调控机制，共同参与多种生理病理过程。Wnt信号是调控器官和组织发育、干细胞分化的重要信号通路，已有报道提示它可能参与了创面愈合、纤维化疾病的发生、纤维化效应细胞的激活，但是具体作用可能存在组织器官特异性，潜在分子机制不明。特别是Wnt信号在真皮成纤维细胞表型转化中的作用，及其与TGF-β1信号的交互调控作用如何，尚不明确。【研究目的】1.明确增生性瘢痕组织及瘢痕成纤维细胞中，Wnt通路关键信号分子的表达调控机制。2.明确外源调控Wnt信号对TGF-β1诱导的真皮成纤维细胞表型转化的具体作用，并初步探讨其作用机制。【研究内容】1.采用实时荧光定量PCR方法，对增生性瘢痕组织和瘢痕成纤维细胞中Wnt通路相关分子的表达进行检测。2.用TGF-β1诱导正常真皮成纤维细胞表型转化，采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法，分别检测成纤维细胞转化过程中Wnt通路关键信号分子的表达变化。3.使用SB216763活化Wnt通路，采用实时荧光定量PCR、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法，检测成纤维细胞表型转化标志分子表达特性的变化；用成纤维细胞三维凝胶收缩实验检测成纤维细胞收缩功能的改变。4.构建β-catenin过表达载体，合成siRNA片段。5.转染β-catenin过表达载体或siRNA片段，用实时荧光定量PCR、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法，检测成纤维细胞表型转化标志分子表达特性的改变。6.用Wnt通路激活剂和转染β-catenin过表达载体的方法干预增生性瘢痕成纤维细胞，实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad3、Smad7的表达变化。7.用重组Wnt细胞因子干预成纤维细胞，观察其对成纤维细胞表型转化的作用。【研究结果】1.与自体正常皮肤相比，增生性瘢痕组织中Wnt2、Wnt3a、Wnt4、Wnt10b的表达水平显著下调。同样，与正常真皮成纤维细胞相比，增生性瘢痕成纤维细胞中Wnt2、Wnt4、Wnt10b的表达水平也显著下调。2.正常成纤维细胞经TGF-β1诱导转分化过程中，Wnt2、Wnt4、Wnt10b的mRNA水平均显著上调。TGF-β1对β-catenin的mRNA水平没有明显的影响，但可以显著上调其蛋白表达水平。3.用Wnt/β-catenin激活剂SB216763与TGF-β1共同作用于正常成纤维细胞后，TGF-β1诱导的α-SMA，Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达被显著抑制；细胞免疫荧光结果显示，α-SMA阳性的肌成纤维细胞数量显著减少。三维凝胶收缩实验显示，SB216763作用后，成纤维细胞的收缩功能被显著抑制。4.成功构建了β-catenin真核表达载体，合成siRNA片段。5. β-catenin过表达载体转染成纤维细胞后，显著抑制了TGF-β1诱导的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达；细胞免疫荧光显示，β-catenin转染后，α-SMA阳性的肌成纤维细胞数量显著减少；而β-catenin表达被抑制后，TGF-β1诱导的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达水平进一步上调。6. SB216763和β-catenin过表达干预增生性瘢痕成纤维细胞后，α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达被显著抑制；TGF-β1和Smad3的mRNA水平被SB216763下调，而Smad7表达水平未出现显著变化。7. Wnt4作用于成纤维细胞，抑制了TGF-β1诱导的α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达；抑制TGF-β1的自分泌机制；还能使肌成纤维细胞发生逆分化。【研究结论】1.真皮成纤维细胞表型转化中，TGF-β1可能通过上调Wnt2、Wnt4、Wnt10b这些Wnt配体分子，激活Wnt/β-catenin信号通路，直接在蛋白水平活化β-catenin。2.外源活化Wnt/β-catenin可以抑制TGF-β1诱导的真皮成纤维细胞表型转化，对TGF-β1诱导的成纤维细胞表型转化起负反馈调控作用。3.外源激活Wnt/β-catenin信号，可抑制增生性瘢痕成纤维细胞中α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达。4. Wnt/β-catenin通路抑制TGF-β1信号的促转分化作用，可能与其抑制了Smad3的表达和TGF-β1的自分泌机制相关。