论文部分内容阅读
苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)在自然条件下主要侵染梨和苹果,在某些栽培梨上引起叶脉黄化和果实的石痘等症状,在栽培苹果上症状不明显。该病毒为β线性病毒科(Betaflexiviridae)凹陷病毒属(Foveavirus)的代表成员。ASPV的基因组为约9300个核苷酸正单链RNA分子,包含5个开放阅读框(Open reading frame,ORF),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2~4组成三基因盒(triple gene block,TGB),编码病毒运动相关蛋白,ORF5编码外壳蛋白(coat protein,CP)。本研究对来源于我国部分地区栽培梨的ASPV的完整CP和TGB基因序列进行了分析;测定了来源于莱阳茌梨(Pyrus bretschneideri cv.Laiyang Cili)的ASPV分离物LYC基因组序列;同时对该病毒TGB蛋白间互作和亚细胞定位特点进行了初步研究。主要研究结果如下:1.对来自于中国4个省的51份梨和4份苹果样品的ASPV带毒情况进行了RT-PCR检测,结果显示35份梨样品和4份苹果样品为ASPV阳性。测定了17份梨样品和2份苹果样品的完整CP基因及16份梨样品和2份苹果样品的完整TGB基因序列。序列分析结果表明该病毒具有较大的分子变异,所获得的所有分离物CP基因核苷酸序列和编码的氨基酸序列相似性分别为63.8-99.8%和69.8-99.8%;所有分离物TGB基因的核苷酸序列相似性为74.8-99.7%,各分离物TGB 1、2、3的核苷酸序列相似性为74.4-99.6%,71.4-99.4%和74.2-100%,推测编码的氨基酸序列相似性为71.3-100%,73.3-100%和65.0-100%。在基于完整CP和TGB基因核苷酸序列的系统进化树中,所测定ASPV分离物均聚为4组。2.测定了来源于中国的莱阳茌梨的ASPV分离物LYC的基因组序列。ASPV-LYC分离物的基因组为9273nt(不包括poly(A)尾),与已报道的分离物基因组结构一致,相似性为69.9-78.3%;而与近期报道的苹果绿皱果相关病毒(Apple green crinkle associated virus,AGCa V)分离物K10相似性较高,为79.9%;该分离物与K10的CP基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列相似性较高,为77.4%和83.2%。对CP的氨基酸序列多重比对的结果显示,该分离物与K10在多个氨基酸位点存在共变异或缺失的特点。在基于全基因组、基因间隔区II(Intergenic non-coding regions,IG-NCRII)的核苷酸序列和CP的氨基酸序列的系统进化树中,分离物LYC均与AGCa V-K10聚在同一分支。在基于Rep的氨基酸序列的进化树中,分离物LYC与来自中国库尔勒香梨的两个分离物KL1和KL9聚在同一分支。在基于IG-NCRI的核苷酸序列的系统进化树中,LYC分离物则与Hannover分离物聚在同一分支。用RDP4软件对LYC的ORF1核苷酸序列进行重组检测,发现分离物LYC存在重组现象,其亲本分别为Palampur和KL9。3.采用酵母双杂交技术测定了ASPV分离物HB-HN6-10的TGBp1、2和3自身及相互间的互作,结果显示该病毒分离物的TGBp可发生自身互作,但未鉴定到这3个蛋白之间的互作。同时发现TGBp1和TGBp3均可与寄主植物西方烟(Nicotiana occidentalis)的AT4/1蛋白互作。将TGB1、TGB2和TGB3基因分别构建至含有黄色荧光标记的植物表达载体,在激光共聚焦扫描电镜下观察注射接种的本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片细胞。发现接种TGBp1的烟叶片细胞在靠近细胞壁和质膜上产生明显的荧光信号,且发现细胞壁和质膜上有不均匀分布的较强的荧光信号点,同时在细胞质内小泡结构有较弱的荧光信号,推测ASPV的TGBp1定位于本氏烟叶片细胞的细胞壁和质膜、胞间连丝和内质网小泡等结构。接种TGBp2的烟草叶片细胞在靠近细胞核、细胞壁和质膜、细胞质内丝状结构中有较强的荧光信号,推测TGBp2分布于烟叶片细胞的细胞核、细胞壁与质膜、内质网中。