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镁离子(Mg2+)是哺乳动物细胞内含量仅次于钾离子的阳离子,是含量最多的二价阳离子,大量研究证实Mg2+参与心血管功能的调节,如血管平滑肌紧张性、内皮细胞功能、心肌兴奋性和核酸合成,是心血管系统常见疾病如高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉硬化性心脏病、充血性心力衰竭和心律失常的重要发病机制之一。由于人体内的Mg2+的跨膜转运的具体机制尚不明了,因此这些疾病中Mg2+相关的致病机制与相应的治疗靶点有待进一步的研究。在高血压的模型中,细胞内镁离子浓度([Mg2+]i)增加可以抑制高血压模型血管平滑肌细胞的收缩、增殖、迁移、分泌及炎症等过程的发生,从而降低血压。小血管增生和重塑是高血压和肺高压（Pulmonary hypertension,PH）共同的病理改变。因此,Mg2+与高血压相关的研究成果对于PH的研究具有较大的参考价值。但是两者又存在本质的区别,因此明确Mg2+在肺循环的调节,以及肺高压发病中的作用对治疗PH具有重要意义。本研究分别在野百合碱（Monocrotaline,MCT）和慢性缺氧（Chronic hypoxia,CH）诱导PH大鼠模型基础上,观察镁转运体（Magnesium transporters）在PH大鼠发病过程中的作用;在动物水平,采用高镁饮食治疗21d,观察Mg2+对PH大鼠的防治作用并探讨可能的机制;在细胞水平,通过不同浓度Mg2+干预PASMCs,检测各浓度处理后细胞的增殖、迁移与凋亡的变化,并采用siRNA瞬时转染沉默镁转运体SLC41A1/2的表达,高表达SLC41A3,观察SLC41A1/2/3对正常大鼠PASMCs的增殖、迁移与凋亡作用,以进一步明确Mg2+及其转运体的作用,为PH发病机制的研究,及其治疗的寻找新靶点。第一部分镁转运体在PH大鼠及高镁饮食PH大鼠PAs中的变化目的:观察镁转运体/离子通道在PH大鼠致病过程中的作用。方法:清洁级雄性SD大鼠（140～160克）予2%MCT（50 mg/kg）一次性腹腔注射,饲养3W,建立MCT组PH大鼠模型;清洁级雄性SD大鼠（200～220克）放于密封的有机玻璃饲养箱内,箱内氧分压调至9.5%～10.5%,饲养3W,建立CH组PH大鼠模型。高镁组给予10%Mg SO410m L/kg/d灌胃,饲养3W。建立6组模型:正常组（CON组）、MCT模型组（MCT组）、慢性低氧组（CH组）、正常对照+高镁饮食组（CON+Mg组）、MCT模型+高镁饮食组（MCT+Mg组）、CH模型+高镁饮食组（CH+Mg组）。（1）血流动力学检测:利用米勒压力导管（Mikro-Tip pressure catheter）测定大鼠肺动脉收缩压（pulmonary arterial pressure,PAP）,计算右心室质量指数（right ventricular mass index,RVMI）的变化;（2）HE染色检测肺动脉（pulmonary arteries,PAs）形态改变,观察大鼠肺动脉平滑肌层肌化程度以及管腔大小;（3）分光光度计检测各组大鼠血清Mg2+浓度的变化;（4）荧光定量PCR:检测不同时间点PH大鼠与高镁饮食PH大鼠PAs的镁转运体mRNA表达的变化。结果:与正常对照组相比,（1）PH模型大鼠的PASP和RVMI均显著增高,肺内小动脉管壁增厚,管腔狭窄,提示成功建立MCT/CH致PH大鼠模型;（2）在MCT与CH分别诱导的PH大鼠PAs上13对镁转运体mRNA随时间的推移均发生变化,且CH中的变化先于MCT,CH组在3-7d即开始发生变化,而MCT组则在7-14d才开始发生变化,其中表达上调的有:Cnnm2,Hip14,Hip14l,Magt1,Mmgt1,Mrs2,Nipa1,Nipa2,Slc41a1,Slc41a2,Trpm7;表达下调的有Mmgt2和Slc41a3;（3）高镁饮食PH组PASP及对应的RVMI均显著下降,肺内小动脉管壁变薄,管腔变大;（4）正常对照组与PH组的血清Mg2+浓度无明显差异,高镁组血清镁浓度均增高（CON:0.87±0.15 mmol/L;CON+Mg:1.38±0.23mmol/L;MCT:0.47±0.22 mmol/L;MCT+Mg:0.93±0.20 mmol/L;CH:0.61±0.17 mmol/L;CH+Mg:1.02±0.16 mmol/L,n=15-20）;（5）高镁饮食PH组PAs上13对镁转运体mRNA表达均发生逆转,向正常方向发展。结论:MCT和CH可分别诱导大鼠产生PH,其机制可能是MCT/CH导致13种镁转运体基因的表达改变,其中:Cnnm2,Hip14,Hip14l,Magt1,Mmgt1,Mrs2,Nipa1,Nipa2,Slc41a1,Slc41a2,Trpm7表达上调;Mmgt2和Slc41a3表达下调,在高镁饮食后,血清镁浓度升高,13种镁转运体基因表达发生逆转,PH缓解。第二部分高镁饮食通过调节镁转运体治疗肺高压目的:观察Mg2+及SLC41A1-3、CNNM2、TRPM7对PH大鼠的预防与治疗作用。方法:高镁组给予10%Mg SO410m L/kg/d灌胃,饲养3W。建立6组模型:CON组、MCT组、CH组、CON+Mg组、MCT+Mg、CH+Mg组。（1）各组大鼠生存率的记录;（2）Western Blot检测PH大鼠PAs的镁转运体SLC41A1-3、CNNM2、TRPM7的蛋白表达变化;（3）mag-Fluo-4AM荧光:胞外镁、SLC41A1激动剂AngⅡ对PASMCs[Mg2+]i的作用;（4）Fluo-3 AM荧光:胞外镁对胞内Ca2+的作用。结果:各组大鼠饲养21d后,（1）PH高镁饮食组大鼠生存率明显提高,MCT组的14d生存率从87.5%提升到100%,21d生存率从79.16%提升到100%;CH组21d生存率从85%提升到100%;（2）与正常对照组相比,MCT组与CH组中SLC41A1,SLC41A2,CNNM2和TRPM7的蛋白水平升高,而SLC41A3降低,在高镁饮食组PH大鼠的PA中,改变的蛋白表达被逆转;（3）在MCT与CH分别诱导的PH大鼠PASMCs胞内静息Mg2+浓度均显著降低（CON组:0.89±0.08 mM,n=7;MCT组:0.52±0.04 mM,n=10,p<0.01;CH组:0.53±0.02 mM,n=23,p<0.01）,且经SLC41A1转运体激动剂AngⅡ诱发后MCT组和CH组的[Mg2+]i降低幅度均较CON组显著增高(Δ[Mg2+]i:CON组:-0.12±0.03 mM,n=7;MCT组:-0.22±0.01 mM,n=4;CH组:-0.20±0.01 mM,n=8);（4）细胞外高镁([Mg2+]e:4.8mM)促进胞外Mg2+流入并增加[Mg2+]i,而将[Mg2+]e降低到0.3或0 mM则会显著降低[Mg2+]i（4.8 mM:0.65±0.12 mM,n=6;0.3 mM:-0.65±0.04 mM,n=6;0 mM:-0.38±0.03 mM,n=6）,表明PH影响了PASMC中Mg2+的运输并降低了[Mg2+]i,[Mg2+]e可以有效地调节[Mg2+]i;（5）不同浓度Mg2+孵育PASMC,对胞内静息Ca2+浓度产生浓度依赖性抑制作用,静息钙（0 mM:153.11±15.12 n M;0.3mM:137.79±10.19 n M;1.2 mM:110.87±3.40 n M;4.8 mM:95.93±1.18 n M,n=6）,钙释放（0 mM:342.09±38.96 n M,0.3 mM:199.78±34.94 n M,1.2 mM:160.48±34.98 n M,4.8 mM:17.67±2.73 n M,n=6）,钙池操纵性钙内流（SOCE）（0 mM:435.06±35.04 n M,0.3 mM:381.46±34.42 n M,1.2 mM:193.84±24.99n M,4.8 mM:52.50±5.32 n M,n=6）,表明PASMCs的[Mg2+]e减少会增强静息[Ca2+]i,SR Ca2+释放和SOCE,而[Mg2+]e增加(如补充Mg2+)则会减少静息[Ca2+]i,SR Ca2+释放和SOCE。结论:这些结果表明,在MCT诱导和CH诱导的PH形成过程中,Mg2+转运蛋白表达的调节发生了显着变化,并且Mg2+饮食补充剂可以有效地恢复Mg2+转运蛋白的正常表达;PH影响PASMC中Mg2+的运输并降低[Mg2+]i;[Mg2+]i可以被[Mg2+]e有效地调节;[Mg2+]e对[Mg2+]i和细胞内Ca2+信号具有浓度依赖性。第三部分Mg2+与SLC41A1/2/3对PASMCs增殖、迁移与凋亡的作用目的:观察Mg2+及SLC41A1/2/3对大鼠PASMCs增殖、迁移与凋亡的影响。方法:在PASMCs上运用不同Mg2+浓度干预PASMCs,检测Mg2+对PASMCs增殖、迁移与凋亡的作用;进行siSLC41A1/2和overexpression SLC41A3（OE-SLC41A3）实验,检测siSLC41A1/2和OE-SLC41A3组PASMCs的增殖迁移与凋亡速率,以明确SLC41A1/2/3在肺高压发病过程中的作用,并探讨可能的机制。（1）荧光定量PCR筛选出合适的siRNA的序列以供后续实验,Western Blot检测转染效率,以保证实验的可靠性;（2）Ed U实验或者MTS实验检测不同Mg2+浓度干预、siSLC41A1/2或OE-SLC41A3后PASMCs的增殖速率;（3）划痕实验检测不同Mg2+浓度干预、siSLC41A1/2或OE-SLC41A3后PASMCs的迁移能力;（4）运用流式细胞仪通过FITC Annexin凋亡试剂盒染色检测不同Mg2+浓度处理、siSLC41A1/2或OE-SLC41A3后PASMCs的凋亡情况,以探讨Mg2+或siSLC41A1/2对PASMCs生长的影响;（5）检测siSLC41A1/2或OE-SLC41A3后NFATc1-5的表达水平;（6）检测siSLC41A1或高镁（4.8mM）处理PASMCs后NFATc3的核转位情况;（7）检测siSLC41A1 PASMCs胞内Ca2+水平。结果:（1）与对照组（1.2 mM）相比,高镁（4.8 mM）抑制PASMCs的增殖和迁移,并促进PASMCs凋亡;低镁（0.3 mM）增强PASMC的增殖与迁移能力,并减少PASMCs凋亡;（2）在CH-PASMCs实验中,对照组（1.2 mM）相比,高镁（4.8 mM）也抑制CH-PASMCs增殖与迁移,并促进其凋亡;（3）利用Q-PCR与Western Blot筛选出SLC41A1/2的有效序列,分别为siSLC41A1-1028与siSLC41A2-438,干扰效率分别为30%与40%;（4）与对照组（MOCK）相比,Slc41a1/2下调和Slc41a3过表达均显着抑制了PASMC的增殖、迁移能力,Slc41a1/2下调显著促进PASMCs的凋亡,Slc41a3过表达对凋亡无明显影响;（5）在低氧（3%O2）处理的PASMC中沉默Slc41a1可以下调NFATc3的mRNA和蛋白质水平,而其他NFATc异构体则保持不变,Slc41a2敲低或Slc41a3过表达后NFATc1-5表达没有明显变化;（6）免疫荧光染色表明,在Slc41a1敲低后,低氧PASMC中NFATc3的核转运明显减弱;（7）与siSLC41A1相似,胞外高镁（4.8 mM）可以显着抑制低氧PASMC中NFATc3的核转运;（8）缺氧PASMCs siSLC41A1后显著抑制胞内Ca2+信号传导,CPA诱导的SR Ca2+释放显着降低（MOCK:233.56±50.16 n M;siSLC41A1:62.89±6.88 n M,n=6）,SOCE显着降低(（MOCK:383.99±79.71 n M;siSLC41A1:89.12±9.09 n M,n=6）,并且在siSLC41A1转染的PASMCs静息[Ca2+]i略有降低。结论:高镁能抑制PASMCs的增殖与迁移并促进PASMCs的凋亡;Mg2+转运蛋白参与了PASMC的增殖和迁移,并可能有助于PH发展中的肺血管重塑;siSLC41A1介导Mg2+和Ca2+之间的交叉相互作用以激活PASMCs中的NFATc3的新型信号通路,该机制可能在PH发展期间在PASMC增殖和迁移中起重要作用。综上所述,PH的发生与PASMC中许多Mg2+转运蛋白如SLC41A1的表达变化有关,从而引起[Mg2+]i降低,使NFATc3活化,促进PASMC增殖与迁移以及血管重塑。这些因细胞内Mg2+缺乏而引起的异常变化可以至少部分地通过补充Mg2+来逆转,这可以作为治疗PH的辅助疗法。