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有益蜡样芽孢杆菌是我国农业部正式批准生产生物制品的菌种,具有调节宿主微生态平衡的功能,广泛应用于饲料、农业、医药保健和食品等各领域。BacilluscereusCMCC63305是本课题组自行筛选的一株可用于人体保健的菌株,已工业化生产成微生态制剂,销量良好。由于芽孢杆菌活菌制剂普遍存在生产过程中压力过大使活菌数和芽孢数减少、有效期内活菌及活芽孢不稳定从而导致产品有效期不长、货架期短的问题,研究活菌制剂的活性保护对于产品质量的优化具有重大意义,同时为其他微生态制剂的生产提供方法学的借鉴。
此外,对活菌制剂的应用范围进行扩大,研发具有生物防治功能的农用微生态制剂对农业生产具有不可估量的应用价值。
本论文首次在蜡样芽孢杆菌的培养中运用Plackett-Burman设计法优化培养基,筛选出基础培养基中的重要因子为葡萄糖,通过浓度优化实验确定适合Bacillus cereusCMCC63305生长的最佳培养基配方(g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,氯化钠5,葡萄糖15,硫酸锰(MnSO4·H2O)1,磷酸二氢钾2,硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5。
在上述实验基础上创新性地通过发酵的不同阶段添加糖类、离子表面活性剂等物质并研究它们对菌体细胞的保护作用。在Bacillus cereusCMCC63305发酵的3个阶段加入谷氨酸钠、海藻糖、聚乙二醇400、甘油和吐温80,通过发酵终止时和4℃保存一段时间后活菌数的测定考察不同物质对细胞生长及活性的影响,发现海藻糖对菌体的保护效果远远优于其它几种保护剂,在发酵初期添加能在180天后使细胞存活率达到66.6%,最佳添加浓度为0.5 g/L。
论文首次对Bacillus cereusCMCC63305在农业上的多种应用进行了探索。首先通过平皿促发芽实验研究了Bacillus cereusCMCC63305对小麦种子发芽能力的影响。浓度为104-106cfu/mL的蜡样芽孢杆菌发酵液可显著促进小麦种子发芽,与对照相比,萌芽率提高了6.0%-11.0%,根长增加了6.57%-10.75%,种子根/芽比值均显著高于对照。同时,田间实验证明了Bacillus cereusCMCC63305能刺激小麦根的生长,增加小麦鲜干重物质的积累。与对照相比,经过菌液处理过的小麦鲜重增加了9.08%-13.00%,干重增加了9.22%-12.90%,株高增加了1.24%-5.57%,且都明显健壮。对Bacillus cereusCMCC63305的促生机理进行了探索,通过溶磷实验和生长素IAA的测定实验发现Bacillus cereusCMCC63305不能分解难溶无机磷和分泌生长素IAA,推测可能具有其他促生功能。
此后,对Bacillus cereusCMCC63305的抑菌作用进行了研究。实验表明106cfu/mL的发酵液对小麦纹枯病有很好的抑制效果,菌丝生长抑制率达86.07%,略低于多菌灵药剂的杀菌效果;对蔬菜灰霉病的抑制率达63.73%,超过腐霉利对蔬菜灰霉病的抑制率51.53%。由平板对峙与杯碟法实验推测BacilluscereusCMCC63305的可能抑菌机制为:通过营养竞争和位点竞争抑制小麦纹枯病菌的生长。
最后采用浸叶碟饲喂法发现Bacillus cereusCMCC63305具有杀虫活性,且随着活菌数的增加,杀虫能力递增。浓度为1.83×1016cfu/mL的菌液对3龄小菜蛾48h的致死率为84.3%,略低于苏云金芽孢杆菌Bt0601在浓度为1.14×1010cfu/mL的情况下对3龄小菜蛾48h的致死率96.7%,其杀虫机理和前景值得深入研究。
Bacillus cereusCMCC63305培养过程中添加活性保护剂和其农业领域的研究成果是本论文的特色,对微生态制剂产品质量的提高和新型生防制剂的研制具有重要指导意义。