朊蛋白错误折叠分子机制及翻译后修饰研究

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人朊蛋白及其病理突变体和人铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)病理突变体的错误折叠分别导致传染性海绵体脑病(prion疾病)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症,在患者体内,这些蛋白质发生错误折叠形成有规则的纤维化聚集体。然而,兔朊蛋白和卵清溶菌酶等不会引起退行性疾病的蛋白质,在体内则不太可能聚集形成纤维。我们用各利,拥挤试剂如Ficoll70、dextran70及PEG20000等来模拟生理的拥挤环境,用荧光光谱法、SDS-PAGE及透射电镜观察等方法研究了生理拥挤环境对上述不同蛋白质聚集形成纤维的影响。研究结果表明,生理拥挤环境大大缩短了人朊蛋白及其病理突变体E196K和D178N聚集的延滞期,强烈促进了其淀粉样纤维的形成;拥挤试剂的加入促进了人SOD1病理突变体A4V的疏水暴露,进而促进了其淀粉样纤维的形成,其中,PEG20000的促进效果尤为明显。相反地,大分子拥挤通过稳定兔朊蛋白单体和卵清溶菌酶单体强烈抑制了这两种蛋白质的错误折叠。100-200g/l的Ficoll70和dextan70对兔朊蛋白和卵清溶菌酶淀粉样纤维形成的延滞期只是些许的抑制,但对最终的纤维形成量有很明显的抑制作用;300g/l的拥挤试剂则几乎完全抑制这些非致病蛋白质淀粉样纤维的形成。我们推断,相比于稀溶液条件,与神经退行性疾病相关的蛋白质在生理拥挤环境中更容易长成纤维;相反,一些非致病蛋白质在生理拥挤环境中则不太可能错误折叠形成纤维。因此生理拥挤环境可能是非致病蛋白质错误折叠的天生防御机制,在蛋白质质量控制体系中发挥重要作用。我们还对大分子拥挤对这两类蛋白质(致病蛋白质和非致病蛋白质)的错误折叠具有相反作用给出了解释。上述研究增加了我们对神经退行性疾病分子机制的了解,而且有益于阐释生理拥挤环境中蛋白质是如何错误折叠和怎样避免错误折叠的。目前体外进行的绝大多数研究建立在原核表达纯化出的朊蛋白基础上,没有任何翻译后修饰,然而翻译后修饰在细胞型朊蛋白向病理性朊病毒蛋白聚集体的转化及传染性海绵体脑病的发生过程中所起的作用尚未完全清楚。因此,我们构建了人朊蛋白的杆状病毒-昆虫细胞表达系统,并利用该系统表达了野生型人朊蛋白及其病理突变体V180I和F198S。Western blot的实验结果表明,由于修饰的不均一性,野生型人朊蛋白在分子量25-50kDa之间,有多个不同的蛋白质修饰状态存在;PIPLC处理和Triton X-114相分离实验表明所表达的蛋白带有GPI锚定修饰。我们通过LTQ Orbitrap MS鉴定了野生型人朊蛋白及其病理突变体的糖基化修饰位点,发现野生型Prion蛋白和V180I在181和197位都有糖基化修饰,而F198S则在181位未鉴定到糖基化修饰;激光共聚焦显微镜的观察结果显示野生型人朊蛋白及V180I均定位于RK13细胞的细胞膜中,而病理突变体F198S和Q217R则大部分定位于胞质。我们推测有些病理突变可能对朊蛋白的翻译后修饰产生了影响,进而影响到朊蛋白的定位,但具体的分子机制还有待进一步研究。
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