肝癌是全球第四大癌症死亡原因,且由于大部分患者在发现时多为晚期,病死率较高,五年生存率低。适用于晚期患者的治疗手段选择范围少,因此寻找安全有效的肝癌治疗策略乃是当务之急。近年来,基于改造患者自身免疫细胞的CAR-T(Chimeric Antigen Receptor-T)疗法蓬勃发展,全球范围内已有两款CAR-T产品上市,另有700多项CAR-T项目正在临床试验阶段,因此该疗法也为肝癌症患者的治疗带来希望。Glypican-3(GPC3)蛋白在大部分HCC患者的肿瘤部位高表达,然而在健康成人的大多组织中几乎检测不到。因此GPC3是HCC治疗的一个理想的靶点。本课题利用电转piggy Bac(PB)转座子系统介导的质粒载体来转染T细胞,制备靶向GPC3的二代CAR-T细胞,并对其在体内外的抗肿瘤效果进行验证。将GPC3CAR基因整合至表达PB转座酶的质粒载体上,随后通过电转染方式得到GPC3CAR-T细胞,利用GPC3抗原和CD28抗体特异性活化并富集表达GPC3CAR的T细胞,Western Blot、RT-q PCR以及流式检测结果表明GPC3CAR基因可高效整合至T细胞基因组;用GPC3抗原包板分别刺激MOCK-T和GPC3CAR-T细胞,结果表明,与MOCK-T相比,GPC3CAR-T细胞可被GPC3抗原刺激活化,使其细胞表面活化分子的表达升高,且倾向于向效应记忆T分化,细胞因子分泌水平也显著高于MOCK-T细胞。此外,GPC3CAR-T细胞的增殖能力也显著强于MOCK-T细胞;在体外比较GPC3CAR-T细胞分别对GPC3阴性与GPC3阳性细胞株的杀伤效果,并检测其细胞因子分泌水平差异。结果表明GPC3CAR-T细胞对肿瘤细胞系的细胞毒作用具有抗原依赖性,GPC3CAR-T细胞只对GPC3阳性的肿瘤细胞系产生较强的杀伤作用;用NSG小鼠建立Huh-7-luc肿瘤模型,根据治疗方式不同,将小鼠分为三组Vehicle组、MOCK-T组以及GPC3CAR-T组。结果显示接受GPC3CAR-T细胞治疗的小鼠,其肿瘤负荷与其他两组相比明显减轻。治疗后第10天,尾静脉采血检测其细胞因子分泌水平以及GPC3CAR基因的拷贝数。结果发现,其IFN-γ的水平显著高于其他两组,且在GPC3CART组的小鼠血样中检测到GPC3CAR基因的拷贝。小鼠处死后,在GPC3CAR-T组小鼠的血液和脾脏中均检测到有T细胞,然而在其他两组中未检测到T细胞。同时,解剖分离小鼠重要脏器做石蜡切片进行HE染色,结果表明CAR-T治疗对小鼠重要脏器未产生毒副作用,在一定程度上证明了GPC3CAR-T治疗的安全性。此外对小鼠肿瘤组织进行包埋制成切片进行IHC染色,结果发现在GPC3CAR-T治疗组的肿瘤组织内有T细胞浸润。综上,我们利用PB转座子系统构建了靶向GPC3的CAR-T细胞,结果表明利用PB转座子系统可将CAR基因高效整合至T细胞基因组中,成功制备CAR阳性率较高的CART细胞,并在体内外表现出较强的抗肿瘤活性。总的来说,我们的研究表明利用PB转座子系统的GPC3CAR-T细胞治疗对HCC患者来说可能是一个比较有前景的临床治疗策略手段。