呼吸道合胞病毒疫苗免疫与感染小鼠模型及其免疫和转录组应答特征

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呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿和老年人呼吸道感染性疾病的病原体。感染患者出现咳嗽、发热和呼吸困难等临床症状,少数情况下可致患者死亡,对全球卫生健康安全构成威胁,给家庭造成巨大负担。接种疫苗是预防病毒性疾病的重要手段,但目前尚无安全有效的RSV疫苗上市。上世纪60年代,福尔马林灭活RSV(Formalin-inactivated RSV,FI-RSV)临床试验表明,免疫接种婴幼儿在RSV自然感染后出现称为疫苗增强性疾病(vaccine enhanced disease,VED)的更严重下呼吸道疾病,表现为发热、气喘、支气管炎和肺炎,导致部分接种婴幼儿死亡。长期以来,VED发病机制不详及担心RSV疫苗接种出现VED现象,极大地妨碍了RSV疫苗的创制。为了加深对RSV疫苗引起VED机制理解,我们制备了紫外线灭活的RSV疫苗(Ultraviolet-inactivated RSV,UV-RSV)。以BALB/c小鼠为实验动物,用UV-RSV进行初免与加强免疫,随后用RSV感染,研究检测了免疫和非免疫小鼠肺组织病理损伤和免疫应答的动态变化;同时采用RNA-seq测序技术和系统生物学方法,研究比较了免疫和非免疫小鼠基因转录表达差异和调控动态特征,取得如下主要成果:1.采用人喉癌上皮(Human larynx epidermoid carcinoma cells,Hep-2)细胞扩增RSV,蔗糖密度梯度超速离心制备纯化RSV。纯化RSV经紫外线照射灭活制备了灭活RSV疫苗(UV-RSV);用UV-RSV对BALB/c小鼠初免和加强免疫,感染RSV后检测免疫与非免疫小鼠特异性体液和细胞免疫应答,建立了RSV疫苗免疫和病毒感染小鼠模型。2.采用RSV疫苗免疫和病毒感染小鼠模型,分别在RSV感染后第1、2、4和6天测定免疫和非免疫小鼠肺组织RSV滴度,组织切片HE染色观察肺组织病理损伤,流式细胞检测分析肺组织T细胞亚类和细胞因子ELISA测定肺组织细胞因子浓度。结果表明,UV-RSV免疫小鼠在RSV感染后第2和4天肺组织中显示低水平病毒复制,第6天病毒完全清除。非免疫(PBS对照)小鼠RSV感染后第1天肺组织中出现高水平病毒复制,至第6天仍维持高水平病毒复制;组织病理学分析结果显示,RSV感染后第1天,免疫和非免疫小鼠肺组织均能观察到明显的组织病理损伤。然而,非免疫小鼠随后肺组织病理损伤程度逐步减轻;而疫苗免疫小鼠肺组织病理损伤持续加重,出现大量炎性细胞浸润。分离肺组织淋巴细胞经细胞表面分子和胞内分子特异性免疫荧光染色和流式细胞仪分析结果显示,免疫小鼠肺组织CD25+Foxp3+CD4+T(Treg)细胞亚类在RSV感染后第1~6天的应答维持在低水平;在非免疫小鼠肺组织中,IL-4+CD4+T(Th2)细胞亚类在RSV感染后第1~6天应答维持在低水平,IFN-γ+CD4+T(Th1)细胞应答在第1~6天呈动态变化,Treg细胞应答在感染后4和6天显著升高(p<0.01和p<0.001);相反,在RSV感染后4和6天,免疫小鼠肺组织Th1和Th2细胞亚类应答均显著高于非免疫小鼠(p<0.05~p<0.001);细胞因子检测结果显示,免疫小鼠在RSV感染后第1~6天,肺组织细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和TGF-β持续高水平表达,均显著高于非免疫小鼠(PBS组)(p<0.05~p<0.001);相反,在RSV感染后第1~6天,免疫小鼠细胞因子IL-6和IL-17浓度均显著低于非免疫小鼠(p<0.05~p<0.001);然而,在RSV感染后第1~4天,免疫小鼠细胞因子IFN-γ和TNF-α浓度显著高于非免疫小鼠(p<0.01~p<0.001);在感染后第6天,该两种细胞因子浓度在非免疫小鼠中显著高于免疫小鼠(p<0.05~p<0.001)。我们第一次报道了RSV灭活疫苗免疫与非免疫小鼠感染RSV后第1~6天CD4+T细胞亚类和相关细胞因子的动态水平。3.采用Illumina测序技术对UV-RSV免疫与非免疫小鼠感染RSV后第1、2、4和6天肺组织进行转录组测序(RNA-seq),应用系统生物学方法对基因表达和转录调控进行分析,首先从RNA-seq数据中鉴定出5582个差异表达基因(differentially expression genes,DE genes)。与非免疫小鼠相比,RSV感染后第1、2和6天免疫小鼠差异表达基因明显减少;相反,RSV感染后第4天免疫小鼠差异表达基因数量明显增多。差异表达基因聚类和功能注释分析显示,差异表达基因主要参与免疫和炎症应答、细胞粘合、血管生成和信号传递等功能。应用STRING和Bio-GRID数据库比对分析构建了差异表达基因时序动态蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。采用Cluster-ONE算法进一步从PPI网络中识别出11个高影响模块(High influential modules,HMs)。这些高影响模块主要参与细胞增殖和发育,信号转导及免疫和炎症应答等功能。我们对涉及胶原纤维形成、细胞粘合、ECM受体相互作用的代表性高影响模块HM5和涉及MHC抗原呈递及免疫应答调节的HM8进行特征分析,结果显示,UV-RSV免疫小鼠HM5中的基因在RSV感染后第4和6天调节关联增加;HM8的基因在免疫小鼠RSV感染早期(第1天)具有紧密调节关系。通过选择8个差异表达基因进行荧光定量RT-q PCR检测,RNA-seq数据与RT-q PCR结果相符,验证了RNA-seq数据的可靠性。这些RNA-seq数据可用于后续研究。我们的结果有助于加深对RSV感染与免疫和疫苗增强性疾病发生机制的理解,对于促进RSV疫苗创制有重要意义。
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