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研究背景及目的恶性肿瘤对人类健康造成严重的威胁。侵袭性生长方式和远处转移性生长往往引起肿瘤原发灶以外的播散,也是影响预后的重要因素。研究表明,恶性肿瘤细胞侵袭性生长的特性由多种因素调控。因此,揭示这些恶性侵袭机制对于肿瘤的基础研究和临床治疗方式选择具有非常重要的意义。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种全球分布具有显著区域性的恶性肿瘤,西方国家较为少见。在南部中国和东南亚洲有较高的发病率,年发病率约为20例/10万人。每年全球新发病例约8万人,死亡人数约5万人。鼻咽癌发病机制非常复杂,包括病毒感染,基因不稳定和环境因素。目前公认为EB病毒感染对地方性和非地方性鼻咽癌的发病具有重要作用。EB病毒最初在鼻咽癌患者血清中被发现,继而人们又在鼻咽癌细胞中发现EB病毒DNA和核抗原,进一步确证了EB病毒与鼻咽癌发病关系密切。研究证实针对EB病毒的衣壳抗原(VCA)的抗体鉴定和患者血浆EB病毒DNA检出对鼻咽癌的预后具有价值。但是近来多项研究发现这种预后评判仍然不具稳定性,而且临床应用价值仍有待考证。随着分子生物技术的发展,研究发现多种信号分子在鼻咽癌细胞中表达异常,包括信号受体如表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、间质-上皮转换因子(c-MET),以及胞内有丝分裂信号通路PI3K/AKT/mTOR的抑制、缺氧诱导因子la(HIF-1a)的表达异常人肝素酶(Heparanase, Hpa)是一种内源性糖苷内切酶。他具有能够降解细胞外基质和基底膜中乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPG)的功能。在骨骼肌、胰腺、肝脏、心及肺等正常组织中极少表达,但是在几乎所有的转移性肿瘤细胞中广泛高表达。研究证实,肝素酶能够诱导肿瘤血管生成、增强肿瘤侵袭特性和促进转移。相反,抑制了肝素酶的表达则能够明显降低肿瘤的增殖和转移。正因如此,肝素酶目前已经成为一种在基因治疗研究中较受关注的肿瘤特异性靶点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指小分子非编码RNA(siRNA)在转录后导致基因沉默(Gene Silencing)的效应[19-20]。目前被广泛运用为基因沉默工具。siRNA沉默基因的原理是通过与互补序列mRNA的特异结合,促使靶基因降解。RNAi技术近年来发展非常迅速,2001年《Science》杂志报道了siRNA能够特异性的沉默哺乳动物细胞基因后[21-22],RNA干扰逐渐成为生物医学研究中的一项重要的实验工具,作为一种转录后基因沉默手段已经在肿瘤、慢性疾病及感染性疾病的治疗中显示出巨大潜力及应用前景。本实验拟通过RNAi技术抑制Hpa在CNE-2鼻咽癌细胞中的表达,并研究沉默Hpa后的CNE-2细胞在肿瘤的生长、侵袭变化情况,为Hpa在作为鼻咽癌基因治疗中的作用提供实验室依据。研究方法1.采用免疫组织化学检测鼻咽癌原发灶及同一病例癌旁正常组织内的Hpa表达情况,并采用免疫细胞化学法检测鼻咽癌细胞株CNE-2中Hpa的表达情况。2.在Genebank中查找人肝素酶mRNA序列片段,应用网络在线工具设计Hpa的干扰序列,并设计干扰序列的dsDNA并进行生物合成；双酶切母体质粒pGenesil-1;将人工合成的dsDNA采用基因克隆的方式装载至酶切后的质粒中,并测序鉴定和扩增备用。3.培养鼻咽癌细胞株CNE-2,用Lipofectamine将重组干扰质粒瞬时转染进CNE-2细胞；经过抗生素G418筛选4周；从残存细胞中挑取单个细胞克隆,扩大培养并备用。4.RT-PCR检测单克隆CNE-2中Hpa的RNA表达；以及Western blot检测单克隆CNE-2细胞中Hpa蛋白的表达水平,通过对比未转染质粒的CNE-2细胞,确定干扰质粒对CNE-2细胞内肝素酶表达的影响。5.采用MTT试验和Transwell体外侵袭试验检测RNA干扰肝素酶后CNE-2细胞增殖生长能力、侵袭能力的抑制程度。实验结果1.免疫组织化学检测鼻咽癌原发灶及同一病例癌旁正常组织内的Hpa表达发现,鼻咽癌原发灶内有显著的Hpa蛋白表达,而同一病例癌旁正常组织内无Hpa表达；同时免疫细胞化学法检测鼻咽癌细胞株CNE-2,发现其内有较高水平的Hpa表达。2.采用www.genscript.com网站的在线设计工具查找肝素酶干扰序列多条,经在线筛选原则筛选后确定得分最高的一条；合成该条干扰序列的dsDNA,并将dsDNA克隆至干扰载体质粒pGenesil-1,经测序鉴定后,命名为pGenesil/Hpa2.采用Lipofectamine法将pGenesil/Hpa转染至CNE-2鼻咽癌中,采用G418压力筛选后,得到单个细胞克隆,并扩大培养后细胞亚株命名为CNE-2/Hpa-。3. RT-PCR结果表明,干扰组CNE-2/Hpa-中Hpa的mRNA表达水平相对CNE-2显著降低；Western blot检测结果证实CNE-2/Hpa-中Hpa蛋白表达水平较CNE-2组显著降低,抑制效率分别达到78.7%。4.MTT实验证实CNE-2/Hpa-组细胞增殖能力显著弱于CNE-2; Transwell体外穿透实验证实,CNE-2/Hpa-细胞穿透基质胶膜能力较CNE-2细胞显著减弱(113±13vs26±5)。结论1.免疫组织化学证实Hpa在鼻咽癌原发灶内高表达,而在同一病例癌旁正常组织内无表达；同时免疫细胞化学法证实Hpa在鼻咽癌细胞株CNE-2内高表达。2.通过在线生物信息学方法,筛选获得1条人肝素酶RNA干扰序列；通过DNA重组方法,成功构建肝素酶RNAi载体；通过Lipofectamine转染及G418筛选,成功获得稳定表达肝素酶RNAi质粒的单个细胞克隆；通过Realtime Time PCR和Western blot方法,证实该干扰序列可以有效地抑制CNE-2鼻咽癌细胞内肝素酶的表达。3.体外实验显示,经过有效干扰Hpa后的CNE-2鼻咽癌细胞在细胞扩增速率、体外穿膜能力等方面均较对照CNE-2鼻咽癌细胞组显著降低。以上研究表明,肝素酶在鼻咽癌细胞的细胞生长增殖和侵袭行为中扮演重要角色；我们构建的人肝素酶干扰序列能有效抑制鼻咽癌的细胞体外增殖和运动侵袭能力,为肝素酶RNA干扰在中晚期鼻咽癌中的治疗作用提供了理论依据。