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盐酸克伦特罗(Clenbuterol Hydrochloride,CLB),又称瘦肉精,化学结构稳定,加热温度至172℃方可分解,极易在动物组织中残留。盐酸克伦特罗对人体危害极大,消费者食用含有瘦肉精的动物肉,会引起急性中毒和慢性中毒。盐酸克伦特罗是我国在动物饲养过程中禁止使用的一种药物,许多国家、国际组织均制定有严格的规定。目前常用的检测CLB的方法主要有酶联免疫法、胶体金快速检测试纸条、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和生物传感技术等,但这些方法分别适用不同的检测对象,各有利弊。因此,开发一种灵敏、便捷的方法检测肉中CLB的残留十分必要。本试验构建了一种基于便携式血糖仪检测CLB残留的方法。试验利用磁性分离技术,建立一种新型磁性免疫生物传感探针检测技术,利用便携式血糖仪检测免疫反应引入的转化酶催化底物产生的信号,准确地定量CLB残留。该方法操作简单、灵敏度高、检测成本低。研究结果如下:(1)以单分散羧基磁珠为载体,盐酸克伦特罗完全抗原(CLB-BSA)为标记物制备磁性免疫传感探针。通过单因素试验研究了CLB-BSA添加量、反应温度、反应时间对偶联率的影响;通过Box–Behnken实验设计,建立了偶联率随CLB-BSA添加量、反应温度、反应时间变化的回归模型:Y=-151.943+7.700X2+6.095X3-0.0175X1X2+0.0125X1X3-0.01745X12-0.13625X22-0.2325X32。回归模型高度显著,失拟项不显著,决定系数高(R2=0.9909),可用于实际预测。自变量对偶联率影响大小的次序为反应温度﹥反应时间﹥CLB-BSA添加量。通过响应面法对磁性免疫传感探针制备中CLB-BSA添加量、反应温度、反应时间进行优化,得到制备条件的最佳参数为CLB-BSA添加量41μg、反应温度25℃、反应时间13 h。在最优条件下进行了5次验证,实际测得的平均偶联率为15.22%,与理论值仅相差0.25%。(2)制备胶体金/二抗/转化酶复合物(Ig G-Au NPs-Invertase)的最佳胶体金溶液pH为8.5、转化酶浓度为120μg/mL,兔抗羊IgG浓度为12μg/mL,转化酶与兔抗羊IgG浓度比为10:1。紫外-可见吸收光谱图显示,制备的胶体金溶液具有较好均一性,采用本试验的标记方法,可成功使二抗、转化酶标记于胶体金表面;透射电镜照片显示,制备的IgG-AuNPs-Invertase颗粒均匀分散,颗粒周围有一圈模糊可见的晕圈,同时粒径变大,说明Ig G和Invertase被成功标记到胶体金颗粒表面。(3)本试验优化了基于便携式血糖仪检测CLB残留的测定条件,结果表明:免疫磁珠探针的用量25μg、CLB抗体1:800稀释、Ig G-Au NPs-Invertase稀释度1:500;转化酶参与水解反应的最适温度为55℃、时间为30 min。(4)本试验构建了一种基于便携式血糖仪检测CLB残留的方法。试验表明,该方法灵敏度高,其检测限为0.1 ng/mL,CLB浓度在0.1~100 ng/mL的范围内,具有良好的线性关系,回归方程决定系数(R2)为0.9969;在1 ng/g(低)、5 ng/g(中)、15 ng/g(高)添加水平下其回收率在85%~94%,标准差在5%以内,说明本方法有较高的准确度;批内变异系数在1.2%~1.6%、批间变异系数在1.1%~8.8%,说明再现性和稳定性较好;对沙丁胺醇和莱克多巴胺有极低的交叉反应性,说明特异性好。(5)向6份未检出CLB的肉样添加CLB,使肉样中CLB的最终浓度为0.2 ng/g、5 ng/g、10 ng/g、15 ng/g、20 ng/g、50 ng/g,并与采集的25份待测肉样进行随机编号,对两种方法同时检出的结果进行显著性分析和线性回归分析,经分析差异不显著;线性方程:Y=0.8787X+0.0668,R2=0.9981,与HPLC法检测结合符合度较高。因此说明本试验构建的方法准确、可靠。