番茄Sly-miR167在植株生长、座果与果实发育等过程中具有重要功能,并且在番茄基因组中存在3个基因座。MiRNA存在多基因座可能是一种重要的调控miRNA表达的方式,具有重要的生理意义。Sly-miR167在番茄中存在三个基因座分别具有不同的启动子,通过研究Sly-miR167启动子的组织特异性、时空特异性以及在外源刺激条件下的响应特性,能够为阐明miRNA多基因座现象及Sly-miR167的表达调控机理奠定基础。本研究从番茄基因组中分离了Sly-miR167三个基因座的启动子片段,将其分别与GUS基因构建融合表达载体,转化番茄,研究其表达的组织特异性和时空特异性,并利用外源激素处理,研究它们对激素的响应特性。主要研究结果如下:(1)采用PCR技术克隆了Sly-miR167三个基因座的启动子片段,利用生物信息学方法对启动子序列进行分析。结果表明,三个启动子均含有植物启动子的特征保守序列,如TATA-box,CAAT-box。另外,Sly-miR167a启动子中含有两个生长素响应元件(AuxRE),三个乙烯响应元件(ERE),三个赤霉素响应元件(GARE);Sly-miR167b启动子中含有两个ERE,一个TGA-element (AuxRE);Sly-miR167c启动子片段含有四个GARE。(2)将扩增的启动子片段分别构建到植物表达载体pMDC162中,与GUS基因融合,然后分别转入根癌农杆菌菌株GV3101中。(3)通过农杆菌介导的方法转化番茄,在潮霉素(20 mg/L)筛选压力下获得抗性植株。经GUS染色鉴定,Sly-miR167启动子-GUS融合基因已经整合到番茄基因组中,成功获得了阳性转基因番茄植株。(4) GUS染色结果表明,在转基因幼苗中,Sly-miR167a和Sly-miR167b启动子能驱动GUS基因在根、茎和叶中表达,且叶中表达最强,茎中次之,根中最弱。Sly-miR167c启动子转基因植株中,GUS基因仅在叶和茎中表达,根中未检测到GUS活性。(5)对转基因植株不同时期的花和果实进行GUS染色,结果表明,三个启动子均能驱动GUS基因在花各个部位表达,但是不同时期存在时空特异性:Sly-miR167a启动子-GUS在开花前2 d和开花当天表达强烈,花后4 d表达变弱并且花瓣中已经检测不到;Sly-miR167b和Sly-miR167c启动子转基因植株中,GUS基因在开花前两天表达强烈,开花当天和花后4 d逐渐减弱。在果实发育的不同阶段,三个启动子也表现出时空特异性:Sly-miR167a和Sly-miR167b启动子在幼果期,绿熟期和破色期表达强烈,成熟期表达减弱;Sly-miR167c启动子在幼果期和绿熟期表达强烈,破色期和成熟期表达较弱。(6)对转基因植株分别进行外源生长素(NAA),赤霉素(GA)和乙烯利处理,结果表明,Sly-miR167a启动子转基因植株经过处理后,GUS基因表达均上调;Sly-miR167b启动子转化株经NAA和GA处理后GUS基因的表达均有显著的上调;Sly-miR167c启动子转基因植株经GA和乙烯利处理后,GUS基因表达显著上调。