大脑是人类已知的最复杂的器官。要想理解大脑的工作原理工,首先必须了解其结构基础,尤其是大脑的神经元连接组。因此,能够在神经环路中定向传播的示踪工具显得尤为重要。基于嗜神经工具病毒的跨突触示踪逐渐成为解析神经环路的重要技术手段。其中,单纯疱疹病毒（HSV）1型毒株H129具有顺向跨突触的能力而作为顺向示踪剂被广泛应用于神经科学研究中。然而,基于H129的示踪剂还有一些缺点需要克服,包括非特异感染和较低的灵敏度等。本论文通过对H129病毒进行遗传学改造,致力于解决H129病毒的这两个重要缺陷。首先,H129是否能作为严格的顺向跨突触示踪剂使用。本论文构建了TK和ICP34.5双基因缺失的H129突变株H306。由于H306在不分裂的细胞中不能增殖,本文以此毒株分别在体内外实验中评估了H129的侵染特性及其逆向标记效率。实验结果表明,无论标记时间长短（3天或10天）,H306均可以高效的标记脑内神经元,且其能够通过轴突末梢吸收的方式大量标记上游脑区投射神经元,显示出明显的逆向标记表型。类推野生型H129也会逆向吸收并且病毒会复制跨突触传播,因此,具有跨多突触标记能力的H129的示踪结果可能是一个混合网络。在解释来自于目前H129工具病毒的顺向示踪结果时需要谨慎。其次,实现开发严谨的顺向H129示踪剂需要有效地消除H129病毒感染轴突末梢的能力,本文的研究思路来源于溶瘤病毒构建策略。这些溶瘤病毒的研究主要聚焦于开发具有靶向感染能力的HSV以溶杀肿瘤。基于此,本文构建了一株重组H129病毒Hs06以重靶向特定类型神经元。Hs06的糖蛋白g D基因重组插入了抗人表皮生长因子受体2型（Her2）的单链抗体序列,利用腺相关病毒（AAV）在特定脑区或者特定类型神经元中表达Her2受体和野生型g D,便可以实现Hs06的特异性感染和单级输出网络的示踪。本文在初级视皮层（V1）环路的实验验证了Hs06的顺向特性,同时解析了外侧下丘脑（LH）和腹侧被盖区（VTA）的GABA能神经元的输出网络,实验结果均与文献中利用电生理与行为学等手段得到的结论一致。因此,结合广泛应用的重组酶转基因小鼠（如cre-品系）,Hs06可以标记特定脑区特定类型神经元的直接投射网络。最后,为提高标记灵敏度,本论文选择了增强H129病毒携带的外源基因表达量的思路。使用类似于特洛伊木马的策略,本文章中构建了一株H129/AAV嵌合病毒H8,以增加外源基因表达框的拷贝数的方式实现荧光基因表达增强。体内外实验均证实H8基因组引入的AAV复制系统可以有效复制H8中外源基因表达框,使得H8的荧光强度显著高于目前的H129示踪工具。荧光增强使得H8可以更快速的进行顺向示踪,而且无需进行免疫组化增强信号。上述结果表明,将AAV复制系统整合到HSV基因组中可以增强外源基因的表达水平。另外该方法也可能作为一个通用策略用于增强基于HSV的基因载体的外源基因表达能力。总的来说,本论文工作系统地研究了现有H129示踪剂的缺陷,并对其进行了改进。本文构建的新型顺向示踪病毒系统可以实现对神经元输出网络的严谨解析,有望在神经环路的研究中发挥重要作用。本文还建立了一种适用于现有H129示踪剂的荧光增强策略,将在缩短实验时间等方面发挥重要作用。