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该文从两个方面对EPO结构与功能进行了探索研究.首先,作者在原核细胞中克隆和表达了rhEPO双体.纯化的原核EPO双体经体内实验证明的确有生物活性.其次,在检测和纯化需要的基础上,作者用纯化的CHO细胞表达的rhEPO免疫小鼠,通过噬菌体表面表达技术制备了抗EPO单抗,获得了抗体的轻,重链可变区基因.对序列结果进行分析,并同EPOR序列进行比较,有利于找出EPOR上与EPO结合的位点,为新型EPO的研制提供理论依据.一、原核表达的EPO双体:EPO双体的连接采用PCR技术,连接肽由9个甘氨酸和两个丝氨酸组成.用两对不同的引物,第一对合成出一个去除了引导序列和终止密码子的EPO,第二对合成出无启始密码子和引导序列的EPO单体,两个PCR产物分别经酶切,克隆,组装成EPO双体,分别插入PBV220,G3203和pGEX5X-1载体中,仅在pGEX5X-1载体中得到了表达;改变EPO双体基因5端GC含量,换用大肠杆菌喜用密码子后,在PBV220和G3203载体中也无可检测到的表达.在pGEX5X-1中EPO双体谷胱苷肽转移酶(GST)融合蛋白的形式表达.SDS-PAGE显示表达产物中有40KD的EPO双体蛋白带,经研究发现是GST融合蛋白发生了体内切割.Western-blot在相应位置上也出现了特异反应带.原核EPO双体表达产物形成包涵体,经纯化,裂解,复性后,分别用杂交瘤单抗和ScFv-39单链抗体制备的亲和柱纯化,比较发现,杂交瘤单抗亲和柱的亲和力较高,但由于此株单抗对酸敏感,不能反复使用,较适于检测.而ScFv-39单链抗体亲和柱亲和力较低,特异性不够.利用CM Gel-Affi Blue柱层析结合GST亲和层析纯化得到EPO双体蛋白;二、抗EPO单抗研究:抗原制备通过Blue-sepharose CL-6B染料亲和柱层析结合C4反相高压层析纯化真核细胞表达的rhEPO,获得了83.5倍的纯化,收率为24.2%.纯化产物经SDS-PAGE电泳,银染证实为一条带,分子量在34KD附近,网织红细胞检测法证实其体内生物活性达128570U/mg.用rhEPO免疫小鼠后,作者用RT-PCR从小鼠脾细胞中调出抗体基因重链和轻链可变区基因库,PCR随机组合连接成ScFv单链抗体库,经SfiI和NotI酶切后插入pCANTAB5E质粒中,用电转法导入大肠杆菌TG1,辅助噬菌体M13K07感染后,进行了三轮筛选,得到一株特异性与EPO结合的噬菌粒.转染HB2151菌后,可溶性表达出ScFv单链抗体.经Western blot检测发现在27KD附近有特异性和EPO结合的条带,利用EPO亲和柱纯化得到的ScFv抗体在SDS-PAGE电泳中检测发现分子量大小亦在27KD附近.ScFv-39基因轻、重链分别用PCR扩增出,克隆进T载体,得基因全长为792bp,其中VH367bp,编码123个氨基酸;VL342bp,编码112个氨基酸,分子量推算为27.215Kd.