硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)是一类膜蛋白，不但在哺乳动物生理过程中扮演重要角色，也与人类阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)、癌症和骨关节炎(osteoarthritis，OA)等许多病理过程息息相关。硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)作为CSPGs的侧链多糖，是由重复二糖单元的葡糖醛酸(glucuronic acid，GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(N-acetyl-galactosamine，GalNAc)以β1,4键及β1,3键连接，并以不同位点硫酸化修饰的酸性黏多糖。在生物体内，不同长度和硫酸化修饰的CS作为功能侧链锚定于CSPG，使其蛋白活性各不相同。　　目前，市场上CS主要来源于牛或者鲨鱼等动物组织。这些CS多糖或寡糖结构高度不均一，表现为糖链长度与硫酸化水平各不相同，不仅使该类药物的安全性受到质疑，同时也限制了CS作为药物的进一步发展。发展非动物来源的生产方法是提高CS安全性、扩大CS应用的迫切需求。部分微生物合成与软骨素结构相同或类似的胞外多糖，例如Escherichiacoli strain K4,Pasteurella multocida type F与Avibacterium paragallinarum genotype I。然而，由于天然荚膜多糖含量低，利用野生菌株发酵法生产CS或其类似物，远远不能满足工业生产的要求。因此，合成糖链长度均一、硫酸化修饰位点确定的CS来取代动物来源的非均一性CS是糖生物化学研究的热点。而能够有效地合成结构单一确定的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)寡糖的化学酶法正日益受到重视。这种方法与传统的化学合成法相比，不但步骤相对简单，总得率高，而且随着合成糖链所含单糖残基的增加，优势也愈发明显。　　作为催化工具的酶分子在寡糖的化学酶法合成过程中发挥着重要的作用。对软骨素合酶(chondroitin polymerase)底物特异性和催化机制的深入研究是使用化学酶法策略来合成结构单一确定的CS的前提。E.coli K4的荚膜多糖为软骨素类似物，其多糖骨架由GalNAc和GlcUA的重复双糖单元交替连接而成，它与软骨素结构的不同之处在于每个GlcUA残基的C-3位皆连接一个果糖残基。K4菌株中软骨素骨架合酶为KfoC，该酶同时包含N-乙酰半乳糖胺转移活性（N-acetylgalactosaminyl transferase，GalNAc-T）和葡萄糖醛酸转移活性(D-glucuronyltransferase，GlcUA-T)两个转糖基催化活性区域。KfoC能够不断的将供体二磷酸尿嘧啶-N-乙酰半乳糖胺(uridine5'-diphosphate N-acetyl-galactosamine，UDP-GalNAc)或二磷酸尿嘧啶-N-葡糖醛酸（uridine5'-diphosphate glucuronic acid，UDP-GlcUA）转移到受体糖链的非还原端，延长软骨素糖链。　　本课题使用大肠杆菌重组表达E.coli K4软骨素合酶KfoC，并合成一系列结构确定的GAG寡糖，不但系统地分析了KfoC底物适应性，而且在此基础上，研究了该酶催化合成糖链过程中底物对酶催化活性的影响。　　首先，E.coli K4软骨素合酶(KfoC)的受体研究发现，不但CS骨架、肝素(heparin，HP)骨架和透明质酸(hyaluronic acid，HA)骨架是KfoC的有效底物，而且HP骨架的N位修饰衍生物也可以被KfoC底物利受。此外，多种天然核苷酸活化的单糖供体(UDP-sugars)及其结构类似物都可以作为KfoC的单糖供体。研究发现，KfoC具有较为宽泛的底物适应性，不仅能够利用天然底物合成软骨素，也可以利用非天然底物合成嵌合GAG寡糖。所以，该酶可作为工具酶应用于非天然结构的嵌合GAG寡糖或单分散性多糖的合成。　　其次，本课题利用生物大分子作用仪Biacore系统研究了KfoC与底物分子之间的相互作用，初步揭示了该酶催化合成糖链过程中单糖供体的种类和受体糖链长度对酶催化活性的影响。表征酶与单一底物亲和力的动力学数据表明，天然底物与酶的亲和力明显高于非天然底物，受体糖链长度的延长可以有效地提高其与KfoC的亲和力。这些数据与Paul L.DeAngelis提出的猜想相吻合。在对KfoC底物适应性深入了解的基础上，本课题还研究了单糖供体-受体底物对与酶的结合顺序对酶催化活性的影响，即初始底物与酶结合后底物-酶复合物对另一个底物亲和力的变化。实验结果表明，天然单糖供体UDP-GalNAc与KfoC的结合能够促进受体GlcUA-pNP与酶形成复合物，进而促使反应发生;而非天然底物UDP-GlcNAc与KfoC的结合却不能促进复合物与受体GlcUA-pNP的结合。这可能就是KfoC能够有效催化UDP-GalNAc与GlcUA-pNP发生反应，而不能催化UDP-GlcNAc与GlcUA-pNP反应的原因。此外，将受体由GlcUA-pNP替换为课题组自主合成的带pNP基团的三糖(Trisaccharide-1,结构为GlcUA-(β1,3)GalNAc-(β1,4)GlcUA-pNP），发现UDP-GlcNAc与KfoC形成的复合物可以有效的识别并结合Trisaccharide-1,并且本课题前期结果已证明KfoC可以UDP-GlcNAc为供体，将GlcNAc连接到Trisaccharide-1上。由此证明GAG合酶催化的聚合反应受到单糖供体种类和受体糖链长度的综合影响。实验发现，先流过供体时，流过受体的响应值增高，但先流过受体时，流过供体的响应值反而降低。通过改变底物流过酶分子的顺序，本论文数据初步支持糖链聚合酶催化反应起始时，酶分子首先结合UDP-sugar，随后结合受体这一酶促反应催化模式的猜想。　　综上所述，本课题重组表达了大肠杆菌来源的软骨素合酶KfoC，检测其催化活性，并对KfoC的底物适应性进行研究。实验证明，KfoC具有较宽的底物适应性，可作为工具酶应用于非天然结构的嵌合GAG寡糖或单分散性多糖的合成。另外，KfoC能够催化UDP-GlcNAc与自主合成的三糖Trisaccharide-1发生反应，却不能催化该供体与GlcUA-pNP发生反应。由此可见，KfoC是一种非常典型的糖胺聚糖合酶模式分子。对酶与底物之间的相互作用研究，不仅有助于揭示糖胺聚糖合酶的催化模式，而且为KfoC的定向进化提供理论支持。