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目的:运用CRISPR-Cas9技术对大鼠AMOT基因进行特异性点突变,在大鼠体内构建出具有稳定基因型的AMOT基因突变模型,为深入研究AMOT基因功能及调控机制创造条件,为FSGS疾病的基因治疗奠定基础。方法:(1)gRNA的设计及体外活性验证:运用麻省理工学院的CRISPR DESIGN网站设计gRNA; PCR扩增出需修饰基因位点处约500bp大小的大鼠AMOT基因片段,并与设计好的gRNA、Cas9核酸内切酶在体外组成CRISPR-Cas9反应体系,置于37℃水浴锅中温育一个小时,用琼脂糖凝胶电泳验证所设计的gRNA片段能否引导Cas9核酸内切酶特异性切割AMOT基因片段。(2)显微注射及基因突变大鼠的构造:将处于发情期的野生型雌性SD大鼠注射30IU孕马血清促性腺激素并在48小时后注射20IU人体绒毛膜促性腺激素以促使其超额排卵,随后立即与野生型雄性SD大鼠交配。次日用CO2安乐死法处死已完成交配的雌性大鼠(检查阴道栓),并从输卵管中取出受精卵细胞置于M2培养基中,37℃,5% C02下培养并准备进行显微注射;通过显微注射将设计的gRNA片段(8ng/ul)、Cas9核酸内切酶(10ng/ul)以及单链DNA模板(3ng/ul)注射进大鼠单细胞受精卵的原核中,将注射完的受精卵细胞置于37℃,5% CO2培养箱中培养,并在当日将存活的受精卵移植进代孕雌性SD大鼠的输卵管内。(3)基因型分析及纯合突变大鼠的培育:上述幼鼠出生两至三周后,剪取约2mm大鼠尾组织提取gDNA; PCR扩增出约500bp大小AMOT基因片段,用Aval限制性内切酶(设计同源修复DNA模板时引入的酶切位点)酶切后,琼脂糖凝胶电泳初步判断是否发生AMOT基因突变,DNA测序确定突变的基因型。将F0代AMOT基因突变大鼠与野生型大鼠进行交配,待F1代大鼠出生后,PCR扩增出其AMOT基因片段与野生型大鼠AMOT基因片段进行DNA杂交,用T7E1限制性内切酶(能够精准识别杂交后DNA中的错配位点并对其进行剪切)初步筛选出具有AMOT基因突变的大鼠并进行DNA测序验证其基因型;将F1代中发生AMOT基因突变的大鼠相互杂交得到F2代大鼠,同样的方法筛选出F2代中具有AMOT基因纯和突变的大鼠。结果:(1)gRNA的设计及体外活性验证:通过麻省理工学院的CRISPR DESIGN 网站设计出的 gRNA 序列为 CTCCATTCTCCACTGGCAGT GGG,琼脂糖凝胶电泳结果显示,同时具有gRNA片段和Cas9核酸内切酶组中的AMOT基因的PCR产物被切割为两个小片段DNA,而Cas9核酸内切酶组(对照组)只有一条约500bp大小的PCR产物,未发生DNA片段剪切。(2)显微注射及基因突变大鼠的构造:本实验显微注射的受精卵细胞总数为98个,显微注射存活率为82% (80/98); F0代共出生大鼠个数为32只,后代的转移出生率为40%;基因型测序结果显示,共有1只大鼠的AMOT基因发生同源修复,未发现非同源修复的大鼠。(3)基因型分析及纯合突变大鼠的培育:F0代共构建出1只同源修复的基因突变大鼠,为雌性杂合子;F1代共构建6只基因突变大鼠,分别为4雄2雌,因为AMOT基因位于X染色体上,故F1代基因突变大鼠中,雄性突变均为纯合子突变,雌性突变均为杂合子突变;F2代共构建基因突变大鼠10只,2只雄性纯合突变大鼠,2只雌性纯合突变大鼠,6只雌性杂合突变大鼠。结论:通过CRISPR-Cas9技术能够在大鼠AMOT基因中引入可遗传的特异性点突变,运用该方法制备的特异性点突变大鼠将极大的促进基因功能的体内研究。