目的：　　复制大鼠去卵巢致骨质疏松病理模型，研究胶原肽对绝经后骨质疏松改善作用及经时特点；筛选并建立过氧化氢（hydrogen peroxide , H2O2）诱导Saos-2细胞损伤病理模型，从氧化应激的角度，分析CP经FBXW7（F-box and WD repeat domain containing 7）-p100-NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）通路保护成骨细胞的分子机制；分析绝经后乳腺癌妇女雌激素水平与REV7表达的相关性，从REV7诱导乳腺癌细胞上皮间充质转化的角度，探究雌激素诱导绝经后乳腺癌的机制。　　方法：　　1.CP改善大鼠去卵巢致骨质疏松的作用：选健康8周龄SD雌性大鼠100只，实验方案：正常组（SHAM）、模型组(OVX)、预防组(CP-P，1g/kg/d)、高浓度肽组（CP-H, 1g/kg/d）和低浓度肽组（CP-L, 0.5g/kg/d）。适应性喂养1周后，仅预防组开始给予CP灌胃。在大鼠12周龄时，除正常组行假手术外，余组均行双侧卵巢摘除术。分别在0W(术后6W)、6W、13W、17W四个时间点，对大鼠股骨X线摄相仪经时摄片，以Image-Pro Plus 6.0软件分析右侧股骨平均灰度值；骨组织切片HE染色后，分别通过ImageJ和Photoshop CS6软件分析骨组织形态计量学参数[骨小梁面积（trabecular area，Tb.Ar）、骨组织面积（tissue area，T.Ar）、骨小梁周长（trabecular perimeter，Tb.Pm）、骨体积分数（relative bone volume, BV/TV,）、骨小梁数量（trabecular number, Tb.N）、骨小梁间距（trabecular separation, Tb.Sp）、骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb.Th）和骨皮质相对厚度（bone cortical relative thickness）的经时变化；免疫组织化学法检测转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）表达；腹主动脉取血，分离血清，Elisa法同期检测骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase, BALP）、I型原胶原氨基端前肽（procollagen type I N-terminal propeptide，PINP）、I型胶原交联羧基端肽（C-terminal telopeptide of type I collagen, CTX-I）和酒石酸碱性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP）水平；酶化学法分别测定丙二醛（malondialdehyde, MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）水平。　　2.CP经FBXW7-p100-NF-κB通路对H2O2诱导的Saos-2氧化损伤的保护作用：以人源成骨细胞系Saos-2为研究对象，MTT法筛选H2O2诱导Saos-2细胞损伤的时间和浓度，同法分析确定CP的实验浓度，建立氧化损伤细胞模型。分别以MTT法检测细胞活性；酶化学法测定细胞内MDA水平和总SOD活性；分光光度法测定细胞内总活性氧（reactive oxygen species, ROS）；Elisa法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性。实验设计：正常组、H2O2组（300μmol/L）、阳性对照组（H2O2+NAC 1mM）、H2O2+CP (200、400、800μg/mL)组、H2O2+CP(800μg/mL)+shp100组、H2O2+CP(800μg/mL)+FBXW7组、H2O2+CP(800μg/mL)+shNF-κB组， H2O2+CP(800μg/mL)+FBXW7+shNF-κB组。通过qRT-PCR和Western blot 检测H2O2诱导的Saos-2细胞中FBXW7、p100和NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）mRNA和蛋白水平的表达情况及CP对其的影响。质粒转染技术和RNA干扰技术构建稳定过表达FBXW7及瞬时干扰的shp100或shNF-κB的Saos-2细胞系。应用上述构建成功的转染细胞系，同法观察细胞活性、ALP活性和ROS水平的变化。　　3.REV7促进乳腺癌细胞侵袭转移的作用机制：收集临床绝经后乳腺癌妇女的瘤体组织（21例）、癌旁组织（15例）和血清标本（14例），免疫组化法检测REV7表达，电化学发光法检测雌二醇（estradiol，E2）水平，线性相关分析评价REV7表达与雌激素水平相关性。Western blot和qRT-PCR检测REV7在发生和未发生转移的乳腺癌组织（各9例）中的表达水平，采用肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas， TCGA）中的Kaplan-Meier生存分析评价REV7表达与乳腺癌患者十年生存率关系；Western blot检测乳腺癌细胞系（MCF7，MDA-MB-231，SK-BR-3，BT549，HCC1428， MCF10A）中REV7基础表达，以及雌二醇对REV7表达的影响；选取REV7高表达的MDA-MB-231和REV7低表达的SK-BR-3细胞应用慢病毒转染技术和RNA干扰技术分别构建稳定沉默或过表达REV7的乳腺癌细胞系。实验设计：空白对照组， MDA-MB-231-shREV7组，SK-BR-3-REV7组。应用上述构建成功的稳定转染细胞，通过Transwell检测细胞迁移能力，Matrigel实验检测细胞侵袭能力，观察REV7表达水平改变对迁移和侵袭能力的影响；通过Western blot检测上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）标志蛋白E-cadherin，α-catenin， N-cadherin，vimentin表达的改变，以及EMT相关信号通路关键蛋白TGF-β1，Snail， Slug，ZEB1的表达变化；干扰敏感蛋白TGF-β1表达后，通过Transwell和Matrigel实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化，采用Western blot检测EMT标志蛋白表达的变化。　　采用SPSS17.0 对实验数据进行统计分析，定量数据的比较用均数±标准差表示，两组间数据比较采用student-t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，p<0.05视为差异有统计学意义。　　结果：　　1. 0W时，OVX组较SHAM组大鼠右侧股骨平均灰度值、骨小梁数量、骨皮质相对厚度和骨体积分数均明显下降，降幅分别达35.86%，29.78%，17.37%，33.51%（p<0.05），并表现出骨小梁间距加大，骨小梁网状结构连续性中断，证明病理模型复制成功。在实验周期内，模型组大鼠右侧股骨平均灰度值、骨小梁数量、骨皮质相对厚度和骨体积分数均呈现经时降低，并表现出骨小梁间距经时加大，不同CP组经时变化情况如下：自6W起CP-P，CP-H和CP-L组右侧股骨平均灰度值均较OVX组明显提高（p<0.05），CP-P组上升幅度达到41.82%（0W vs 17W，p<0.05）；与0W相比，17W时OVX组Tb.N降幅达30.36%（p<0.05），而CP-P，CP-H和　　CP-L组升幅分别达37.7%，37.8%，26.58%（p<0.05）；而CP-P，CP-H，CP-L组分别自6W，13W，17W始明显增加骨皮质相对厚度（vs OVX组，p<0.05）；17W时CP-P 和CP-H组BV/TV与SHAM组相比已无统计学差异（p＞0.05）；而CP-P组Tb.Sp自6W起较OVX组明显下降，至17W时，CP-P，CP-H和CP-L组Tb.Sp分别较0W时下降达43.68%，40.65%，28.82%（p<0.05）。OVX组TGF-β表达降低（vs SHAM组，p<0.05），而各CP实验组中其表达被逆转。实验周期内，与SHAM组相比，OVX组大鼠血清总SOD、BALP和PINP水平经时降低，MDA、TRAP和CTX-1水平经时升高，CP可逆转上述指标变化，其中CP-P组BALP（自6W起）和PINP（自0W起）水平明显提高，与OVX组相比，差异有统计学意义（p<0.05）；自0W起即显著降低TRAP和CTX-1水平，与OVX组相比，差异明显（p<0.05）。与OVX组相比，CP-P，CP-H，CP-L组分别自0W，6W，13W明显降低MDA水平（p<0.05），而自0W，6W，17W明显升高总SOD活性（p<0.05）。CP能够经时增加Tb.N，减小Tb.Sp，提高BV/TV，一定程度改善骨小梁网状结构连接完整性，提高血清总SOD、BALP和PINP水平，降低血清MDA、TRAP和CTX-1水平，且不同CP组间分别自不同时间点表现出对指标的明显改变，而相同时间点又以CP-P组变化最为显著。　　2. 以300μmol/L H2O2损伤Saos-2细胞6h建立细胞损伤模型。与正常对照组相比，H2O2损伤组细胞活性、ALP活性、总SOD活性分别下降46.6%（p<0.01），50.33%（p<0.01），61.63%（p<0.01）；MDA和ROS水平上升，分别为对照组的3.31倍（p<0.01）和3.34倍( p<0.01)；而CP能逆转H2O2诱导的细胞活性、ALP活性、总SOD活性下降( p<0.01，p<0.05，p<0.01)，及MDA和ROS水平上升(p<0.05，p<0.01)。qRT-PCR和Western blot结果显示，H2O2显著促进FBXW7和NF-κB mRNA和蛋白水平的表达（p<0.01，vs对照组），抑制p100 mRNA和蛋白水平的表达（p<0.01， vs 对照组）；用不同浓度CP预处理细胞后，CP显著逆转了H2O2对靶蛋白的影响。Western blot和qRT-PCR分别验证细胞构建成功。当过表达FBXW7时，过表达组p100表达受到明显抑制（p<0.01, vs CP预保护组），NF-κB表达显著上调（p<0.01, vs CP预保护组），而当沉默p100时，p100沉默组NF-κB表达明显上调（p<0.01, vs CP预保护组），初步印证Saos-2细胞中三个靶蛋白之间具有相互调控作用。进一步通过比较改变靶蛋白表达时对细胞活性、ALP活性和ROS水平的影响，发现与CP预保护组相比，FBXW7过表达组和p100沉默组细胞活性（p<0.01，p<0.01）和ALP活性（p<0.01，p<0.01）下降，ROS水平上升（p<0.01，p<0.01）；当在过表达FBXW7的基础上沉默NF-κB表达时，与过表达FBXW7组相比细胞活性（p<0.01）和ALP活性（p<0.01）明显回升，ROS水平降低（p<0.01），从而证明CP通过FBXW7-p100-NF-κB通路发挥其对H2O2氧化损伤Saos-2细胞的保护作用。　　3. 免疫组化结果示REV7在绝经后乳腺癌妇女癌组织中高表达，阳性细胞均数达42.73±11.56%，与癌旁组织阳性细胞均数（18.45±6.27%）相比，差异具有统计学意义（p<0.01），且在远处转移乳腺癌组织中，REV7 mRNA和蛋白表达水平相较非转移乳腺癌组织亦显著上升（p<0.01）；血清E2水平在绝经后乳腺癌妇女中达到150.75±45.13pg/ml，其中有雌激素补充史者更高达203.45±56.77pg/ml，较正常绝经后妇女26.61±14.44pg/ml明显升高（p<0.01），且与非转移乳腺癌妇女血清E2水平（123.94±43.38pg/ml）相比，远处转移乳腺癌妇女血清E2水平明显上升（p<0.05），达到177.55±29.24pg/ml；线性相关分析结果显示REV7阳性细胞数与雌二醇水平存在一定的正相关性（R2=0.6757, p=0.003），Western blot进一步在细胞水平证实雌二醇促进乳腺癌细胞REV7表达。肿瘤基因图谱表明REV7低表达的乳腺癌患者其十年以上生存率约在40%，而REV7高表达的乳腺癌癌患者生存率仅为20%，该靶标分子与乳腺癌患者术后十年生存率呈负相关（log rank P=4.8e-07）。嘌呤霉素筛选后，应用qRT-PCR和Western blot证明细胞构建成功。应用上述构建成功的稳定转染细胞，通过Transwell检测穿过小室膜孔的数量，发现过表达REV7后，SK-BR-3细胞穿过小室膜孔的数量增加，而沉默REV7后，MDA-MB-231细胞穿过小室膜孔的数量减少；通过Matrigel实验检测穿过基底膜和小室膜孔的数量，发现过表达REV7后，SK-BR-3细胞穿过基底膜和小室膜孔的数量上升，而沉默REV7后， MDA-MB-231细胞穿过基底膜和小室膜孔的数量下降，REV7能够促进乳腺癌细胞体外迁移和侵袭（vs 对照细胞，p<0.01）；REV7能够抑制上皮细胞标志蛋白E-cadherin，α-catenin的表达，促进间质细胞标志蛋白N-cadherin，vimentin的表达；REV7能够激活EMT相关信号通路关键蛋白TGF-β1的表达，沉默TGF-β1可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力（vs 对照细胞，p<0.01），逆转REV7诱导的上皮细胞标志蛋白的表达下调以及间质细胞标志蛋白的表达上调。　　结论：　　1. CP改善大鼠骨质疏松的作用与减轻氧化损伤，促进骨形成，抑制骨吸收有关。　　2. FBXW7是CP抵抗氧化应激引起骨质疏松的关键因子之一，CP对H2O2损伤Saos-2细胞的保护机制与通过FBXW7/p100/NF-κB通路减少或避免细胞氧化损伤，促进成骨细胞增殖和成骨分化有关。　　3. E2激活REV7表达，通过REV7诱导乳腺癌细胞的EMT进而促进乳腺癌细胞的侵袭迁移；TGF-β1在REV7促进乳腺癌细胞侵袭迁移中发挥重要作用。