第一部分儿童舒张功能障碍心肌病的临床和致病基因特点及预后分析目的:儿童舒张功能障碍心肌病主要包括肥厚型心肌病(HCM)和限制型心肌病(RCM),由于缺乏有效的治疗手段,预后差。本研究拟通过收集单个儿童医疗中心近10年来儿童舒张功能障碍心肌病患儿的临床资料,以收缩功能障碍心肌病患儿作为参照,对比分析舒张功能障碍心肌病患儿的发病情况、临床特点、预后及危险因子。并通过基因检测和分析,总结舒张功能障碍心肌病的致病基因特点。方法:(1)收集自2007年11月至2017年12月重庆医科大学附属儿童医院住院的4种心肌病患儿包括HCM、RCM、扩张型心肌病(DCM)和左室心肌致密化不全(LVNC),共317例。(2)回顾性分析心肌病患儿的一般情况、临床症状与体征、心电图、超声心动图等资料,随访其预后情况。(3)通过Kaplan–Meier生存曲线分析各组的生存率和生存时间;利用Cox比例风险回归模型对与心肌病和心力衰竭(HF)相关的因素进行预后风险评估。(4)以近2年就诊随访的21例伴有舒张功能障碍的HCM和RCM患儿为研究对象,经血液采集、全血基因组DNA提取、文库构建、文库捕获、测序及数据分析等过程进行全外显子测序分析。结果:(1)317例心肌病患儿包括HCM 80例(25.2%)、RCM 32例(10.1%)、DCM 127例(40.1%)和LVNC 78例(24.6%)。(2)男女比例为168:149,平均年龄4.5±4.4岁,年龄在各组存在统计学差异(P?0.01);11例(3.5%)有心肌病家族史。(3)151例(47.6%)心肌病合并有肺炎,最常见的临床表现是呼吸困难(84.2%),其次是肝肿大(59.3%)、紫绀(58.4%)、心脏增大(50.8%)、心脏杂音(43.2%)、外周水肿(37.2%)等;DCM、LVNC和RCM中,50%以上患儿心功能≥NYHA/Ross III级。(4)35%心肌病患儿表现有心电图异常;HCM和RCM超声心动图主要表现为舒张功能障碍:左室等容舒张时间(IVRT)﹥80ms,E/A比值异常,LVEDD?40mm;DCM和LVNC超声心动图主要表现收缩功能障碍:射血分数(EF)?50%,左室舒张末期内径(LVEDD)﹥40mm。(5)各组累计生存率存在统计学差异(P?0.05);HCM、RCM、DCM和LVNC患儿的5年和10年生存率分别为67.3%和56.1%、51.1%和41.3%、75.5%和60.1%以及74.1%和57.2%;随访期间,92例(29%)心肌病患儿死亡,其中HCM 23例(28.8%),RCM 16例(50%),LVNC 23例(29.5%)和DCM 30例(23.6%),各组间的死亡概率具有统计学差异(P?0.05)。(6)Cox比例风险回归分析显示,HCM的预后与颈静脉扩张、肝脏增大、NYHA/Ross III级及以上、P-R间期、EF、左室后壁厚度、心包积液和预激综合征有关;RCM的预后与男性、家族史、端坐呼吸、NYHA/Ross III级及以上、P-R间期和LVEDD有关;DCM的预后与NYHA/Ross III级及以上、QTc间期、EF、缩短率(FS)和中重度三尖瓣返流(TR)有关;LVNC预后与QRS波、右室舒张末期内径(RVEDD)和左室致密层心肌与非致密层比值(N/C)有关。(7)本组21例HCM和RCM患儿,17例(80.9%)发现有基因异常;9例RCM中,5例检测出基因突变,其中3例携带TNNI3基因第192位氨基酸位点突变;所有(12例)HCM患儿均检测到基因突变,其中5名HCM患儿携带MYH7基因突变。结论:(1)本研究中心肌病患儿HCM和RCM占比较低,RCM最低,DCM占比最高。(2)HCM和RCM以舒张功能障碍为主,DCM和LVNC以收缩功能障碍为主,HCM的临床症状相对较轻,HCM和RCM生存率较低,预后较差,RCM最差。(3)多个因素与心肌病的预后相关,NYHA/Ross≥III级与DCM、LVNC和RCM患儿的死亡风险呈正相关。(4)本研究中大部分舒张功能障碍心肌病患儿携带有基因突变,主要位于编码肌小节蛋白的基因,其中MYH7突变在HCM最常见,TNNI3突变在RCM最常见。(5)基因型和表型之间存在交叉重叠,部分HCM发病可能与先天代谢因素有关,需要早期进行基因及相关检测。第二部分限制型心肌病的病理及肌钙蛋白I分析目的:由第一部分研究可知,儿童RCM起病隐匿,在心肌病中死亡率最高,预后最差;心脏肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)突变是RCM常见的致病原因。心肌组织病理分析对于RCM的诊断、鉴别诊断、疾病的进展和组织学特点的深入认识非常重要。本研究将收集患有舒张性HF的RCM病例的组织进行病理对比分析,并对相关致病蛋白c Tn I进行检测。方法:(1)收集临床资料与心脏标本。(2)HE、Masson、PAS和刚果红染色分析RCM病例和对照组的心、肺、肝以及肾脏组织病理改变。(3)透射电镜观察心肌纤维的超微结构。(4)以1岁、40岁和52岁无心脏疾病心脏以及RCM心脏为研究对象,利用蛋白印迹(WB)检测c Tn I的表达水平差异。结果:(1)RCM患儿以心功能不全为主要临床表现,超声心动图呈双心房增大和限制性充盈障碍等典型表现,携带c Tn I R192C基因突变。(2)与对照组比较,RCM心脏病理改变呈双心房增大,心室腔狭窄,心室内膜增厚;HE染色显示心室心肌排列紊乱不规则,细胞核大、深染;Masson染色显示心室及内膜下胶原纤维明显增生,肺血管壁胶原纤维增生明显,心脏PAS和刚果红染色未见异常;透射电镜结果显示,左室心肌肌丝排列紊乱或溶解,Z线扭曲,纤维间水肿较明显,线粒体排列紊乱、空泡样变,结构破坏。(3)与对照组比较,RCM肺脏体积增大,被膜紧张,切面呈暗红色,质地变硬,全肺存在散在铁锈色斑点;HE染色显示肺泡结构破坏,肺淤血部位肺泡腔内充满水肿液,可见较多含铁血黄素颗粒以及心衰细胞;Masson染色显示血管壁增厚,胶原纤维增生明显。(4)与对照组比较,RCM肝脏体积增大,包膜紧张,切面呈暗红色,质地较硬;HE染色显示肝小叶结构紊乱,肝细胞萎缩,变性坏死;Masson染色显示肝细胞间质胶原纤维增生明显及纤维素沉积。(5)与对照组比较,肾脏体积增大,被膜紧张,肾皮质和髓质切面呈暗红色,质地变硬;HE染色显示肾单位结构轮廓模糊,肾小球毛细血管扩张、淤血,肾小管细胞肥大;Masson染色显示肾小管细胞间质及血管壁胶原纤维增生明显。(6)RCM和老年心脏左室及室间隔心肌组织c Tn I蛋白表达较青壮年低;RCM左室及室间隔心肌组织c Tn I蛋白含量较其右室低,其中,左室部位含量最低。结论:(1)RCM主要表现为双心房增大,心室壁僵硬程度增加以及限制性充盈障碍,可发展为舒张性HF,可能与心肌肌丝溶解破坏以及心肌间质纤维化有关。(2)严重慢性HF可引起肺、肝、肾等组织淤血和病变。(3)c Tn I突变所致RCM患儿的左室及室间隔c Tn I蛋白表达下降,其水平与老年心脏相似。第三部分限制型心肌病小鼠舒张功能障碍的实验性治疗研究目的:由第一二部分研究可知,RCM主要表现为舒张功能障碍,最终发展为舒张性HF;舒张功能障碍的治疗以对症治疗为主,手段有限,心脏病理改变严重,预后差。本研究在美国合作实验室的黄旭培教授的帮助下,采用两种不同作用机制的小分子化合物(第一种是作用于心肌粗肌丝肌球蛋白的化合物,即M-化合物;第二种是作用于心肌细肌丝肌钙蛋白的化合物儿茶素EGCG,即T-化合物),对RCM转基因(TG)小鼠进行实验性治疗,比较这两种小分子化合物对RCM TG小鼠心脏功能的治疗效果差异。方法:(1)以野生型(WT)和RCM TG小鼠为研究对象,M-化合物干预组随机分为溶剂、0.3mg/kg以及1mg/kg组;T-化合物干预组随机分为溶剂、50mg/kg以及200mg/kg组。所有小鼠在干预前进行高频心脏超声检测。(2)M-化合物按照剂量后颈部皮下注射,2h后进行高频心脏超声检测;等体积溶剂组进行同样操作。(3)T-化合物EGCG50mg/kg/day,腹腔注射3个月(从2月龄起),等体积溶剂DMSO进行相同操作,持续3个月;干预结束后进行高频心脏超声检测;EGCG200mg/kg,单次腹腔注射,等体积溶剂组进行同样操作,观察动物状态。结果:(1)与WT小鼠相比,TG小鼠的IVRT延长,组织多普勒E’降低,E’/A’比值异常,E/E’比值增加(P?0.05),而EF和缩短率(FS)两组无差异(P>0.05)。(2)0.3mg/kg M-化合物干预后,WT小鼠的收缩功能和舒张功能未见明显改变(P>0.05);TG小鼠IVRT、E’和E/E’等指标部分或完全逆转(P?0.05),EF和FS无明显变化(P>0.05);LVEDD、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期内径(LVESD)和左室收缩末期容积(LVESV)明显降低,差异具有统计学意义(P?0.05)。(3)1mg/kg M-化合物干预后,WT小鼠的舒张功能未见明显改变(P>0.05),LVESD和LVESV有显著增加,而EF和FS明显降低,差异具有统计学意义(P?0.05);TG小鼠IVRT、E’和E/E’等指标部分或完全逆转,LVESD和LVESV显著增加(P?0.05);但EF和FS显著降低(P?0.05)。(4)50mg/kg/day T-化合物EGCG干预后,WT小鼠的收缩舒张功能未见明显改变(P>0.05);TG小鼠的IVRT完全逆转,LVEDD、LVESD、LVEDV和LVESV显著增加(P?0.05);各组EF和FS无明显变化(P>0.05)。(5)采用4倍剂量200mg/kg T-化合物EGCG干预WT和TG小鼠,均无异常表现和死亡。结论:(1)作用于肌球蛋白的M-化合物在一定程上可以改善RCM小鼠心脏舒张功能,但对收缩功能有一定不良影响;高剂量可严重损害收缩功能,作用具有一定的剂量依赖性。(2)作用于肌钙蛋白的T-化合物长期小剂量使用,小鼠耐受性好,RCM小鼠心脏舒张功能得到改善,收缩功能不受影响,具有一定的应用前景,优于M-化合物。第四部分儿茶素治疗舒张功能障碍心肌病患儿的临床医学转化探索目的:由前三部分研究可知,HCM和RCM以舒张功能障碍为特征,中晚期病情重,治疗手段有限,预后差;儿茶素EGCG安全性好,可以改善患有舒张功能障碍心肌病小鼠的舒张功能而对收缩功能没有影响;在本研究中,我们将通过比较心肌病患儿儿茶素干预前后的心脏功能,初步验证儿茶素EGCG治疗舒张功能障碍心肌病患儿的有效性和安全性。方法:本研究纳入了12例伴有舒张功能障碍的心肌病(HCM和RCM)患儿,年龄0.8到14.2岁。患儿口服儿茶素,初始剂量为15mg/kg/day,逐渐添加至50mg/kg/day,持续12个月;同时接受常规治疗。所有患儿在儿茶素治疗前后均进行了超声心动图、实验室和心电图等检查。结果:(1)使用儿茶素6个月后,LVEDV(40±28 vs 53±28 ml,P=0.028)增加了17.1%,每搏输出量(SV,25±16 vs 32±17 ml,P=0.022)提高了14.9%,IVRT显著下降(P=0.047);12个月后,LVEDV(40±28 vs 48±33 ml,P=0.011)增加了17.0%;SV(25±16 vs 30±17ml,P=0.022)提高了23%,E/A比值有所改善(P=0.018),IVRT显著下降(P=0.033)。LVESD、LVEDD和LVESV治疗前后未见明显变化(P>0.05)。(2)收缩功能指标EF以及心室壁厚度和心房大小无明显变化(P>0.05)。(3)心率和血压无明显变化(P>0.05)。(4)所有患儿无明显的副作用表现。结论:(1)儿茶素EGCG可以改善心肌病患儿舒张功能障碍,减轻临床症状,可能为舒张功能障碍心肌病患儿的心脏移植治疗争取时间;(2)以本研究中使用的剂量将EGCG作为每日补充剂使用是安全的,无明显的副作用。