论文部分内容阅读
近年来我国近海海域浒苔大量爆发,对沿海的旅游业、养殖业、海洋生态环境等行业造成严重的威胁。浒苔中多糖含量高达50%以上,且浒苔短期内可形成可观的生物量,是一种亟待开发的资源生物;而通过微生物可实现浒苔多糖的高值化利用。本论文在获得一株浒苔多糖高效利用菌株Vibrio sp.H11的基础上,对其水解浒苔多糖进行条件优化,并探讨丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum B3)发酵利用浒苔及浒苔多糖酶解产物产生物气体和生物溶剂;同时采用转录组测序、RT-qPCR验证及基因克隆与重组表达等手段探寻浒苔多糖特异性水解酶,主要结果如下: 经Vibrio sp.H11的培养条件优化,发现在浒苔多糖(Enteromorpha polysaccharides,EP)浓度为20g/L,胰蛋白胨浓度为5g/L,温度为30℃,pH为8.71时,H11菌株发酵胞外粗酶液的酶活力最高可达8.43U/mL,明显高于优化前。当酶活力为8U/mL时,H11胞外粗酶液与1%的EP溶液反应1h其水解率为4.92%。结果表明H11胞外粗酶液即可水解EP,这将有助简化水解酶的分离纯化及鉴定,并促进浒苔多糖及其寡糖的高值化利用。 在上述基础之上,分别将浒苔粉末及浒苔多糖经H11胞外粗酶液处理,所获水解产物用于Clostridium acetobutylicum B3菌株发酵。发现与未经H11胞外粗酶液处理的对照相比,当浒苔粉末含量为5%时,可多产28.43mL的生物气体和1.05g/L的生物溶剂。而当浒苔多糖含量为5%时,可多产35.35mL的生物气体和0.46g/L的生物溶剂。结果显示,浒苔粉末或浒苔多糖经H11菌株胞外粗酶液水解处理后更有利于B3菌株产生物气体和生物溶剂;而其中,处理后的浒苔多糖比浒苔粉末效果更佳,更具产生物燃料的价值。这同时也证实H11菌株胞外粗酶液对浒苔多糖的水解作用及水解产物的应用潜力。 除对Vibrio sp.H11菌株进行胞外酶研究以外,还分别以果糖和EP为碳源,进行H11菌株发酵,经转录组测序,发现胞内与浒苔多糖水解相关的主要通路有淀粉和蔗糖代谢通路,果糖和甘露糖代谢通路以及半乳糖代谢通路等。而主要的水解酶是糖苷水解酶(GH)家族和糖基转移酶(GT)家族。GH家族有23个基因,其中GH13家族数量最多,而GT家族有4个基因。并且,采用RT-qPCR的手段证实其中的β-1,4纤维二糖水解酶、ɑ-淀粉酶和支链淀粉酶在浒苔多糖的诱导下明显上调。结果有助诠释H11菌株水解浒苔多糖的机理,并可作为关键水解酶而应用于浒苔多糖开发利用研究。 进一步地,对菌株H11中的淀粉酶Amy3615成功进行了原核表达,发现重组蛋白最适反应温度为30℃,最适pH范围较宽从pH6.0至pH9.0。而酶学特性分析表明,Amy3615对Fe3+、Co2+、Cu2+等金属离子较为敏感,在低浓度时就对其酶活力有很强的抑制作用。常见的表面活性剂及有机试剂中没有明显促进Amy3615酶活力的试剂。酶解功能实验发现,Amy3615与浒苔多糖反应4h,其水解率为3.7%左右。这表明该重组酶对浒苔多糖具有水解作用,可用于浒苔多糖及其水解产物的综合利用。 总之,Vibrio sp.H11中具有高效水解浒苔多糖的水解酶系,可通过上述的方法获得。浒苔多糖具有很好的生物燃料价值,可作为新一代生物质燃料的原材料。