背景：　　慢性阻塞性肺疾病（COPD）的特征性病理改变表现在气道、肺实质及肺血管，肺组织不同部位出现特异性炎症细胞增多的慢性炎症，以及反复损伤与修复后出现的结构改变。气道炎症及重构通常与疾病的严重程度密切相关。前期研究显示，气道平滑肌迁移在气道重塑中可能起重要作用，同时气道平滑肌能够分泌多种因子，可能参与气道慢性炎症发生发展。近年来的研究表明，空气污染物特别是PM2.5是COPD发病的重要因素之一，但是，PM2.5对人气道平滑肌的影响研究甚少。探讨PM2.5对气道平滑肌的影响对于阐述慢阻肺气道重塑的机制具有重要意义。　　目的：　　比较交通主干道PM2.5（Arterial Traffic ambient PM2.5,TAPM2.5）和生物燃料烟雾相关PM2.5（Wood smoke PM2.5，WSPM2.5）对人气道平滑肌细胞迁移和分泌功能的影响，并观察Shh通路在其中的可能作用，阐述PM2.5导致慢阻肺气道重塑的可能机制，为有效防治慢阻肺提供新的靶点。　　方法：　　1.PM2.5对细胞活力、增殖、凋亡的影响　　（1）实验用原代人支气管平滑肌细胞（HBSMCs），复苏传代培养，3-8代细胞用于实验。向96孔板中加入5×103个细胞/孔，分别加入不同浓度的PM2.5(TAPM2.50、7.5、15、22.5、30、37.5、45μg/ml，WSPM2.50、1、2、3、4、5、6μg/ml)，作用24h后，再向每孔细胞中加入10μl CCK-8试剂，37℃生化培养箱继续孵育2h，然后在450nm波长处测定细胞吸光度值来检测细胞活力。　　（2）向12孔板中加入7.5×104个细胞/孔，分别加入15μg/ml TAPM2.5或者3μg/ml WSPM2.5，作用48h后以胰酶消化，收集细胞悬液计数以判断细胞增殖情况。　　（3）用FITC/PI试剂盒测定细胞的凋亡情况。向6孔板中加入1.5×105个细胞/孔，再分别加入TAPM2.5(15μg/ml)或者WSPM2.5(3μg/ml)或者不同的浓度梯度的PM2.5，作用72h后，根据FITC/PI凋亡试剂盒说明书的指引测定HBSMCs凋亡情况。　　2.PM2.5对人气道平滑肌细胞迁移能力的影响　　以不含血清的DMEM/F-12重悬HBSMCs，加入1×105个细胞/孔在transwell上室，下室加入含10%血清的DMEM/F-12。将15μg/ml TAPM2.5或者3μg/ml WSPM2.5加入下室，作用6h后，固定细胞，结晶紫染色后用棉签轻轻拭去上室细胞，200×光镜下观察5个视野，观察细胞的迁移状况。　　3.PM2.5对人气道平滑肌细胞分泌功能的影响　　（1）TGF-β1或BDNF测定：向6孔板中加入1.5×105个细胞/孔，分别加入TAPM2.5(30μg/ml)或者WSPM2.5(6μg/ml)培养0、0.5、6、12、24、48h，收集培养至时间点的细胞培养基上清，将细胞培养基上清加入到样品孔内室温孵育2h，加入TGF-β1或BDNF结合液孵育1h或2h，再加入显色液反应30min，加入终止液后置450nm波长测定OD值。　　（2）炎症因子测定：向6孔板中加入1.5×105个细胞/孔，分别加入TAPM2.5(30μg/ml)、WSPM2.5(6μg/ml)培养0、0.5、6、12、24、48h，收集培养至时间点的细胞培养基上清，向样品孔加入稀释的磁珠、标准品、细胞上清液，避光孵育30min，加入抗炎症因子抗体反应30min，SA-PE反应10min，加入工作液重悬后置Bio-Plex system读数。　　结果：　　1.PM2.5对人支气管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响：PM2.5（TAPM2.515μg/ml、WSPM2.53μg/ml）不能引起HBSMCs增殖、凋亡；当TAPM2.5刺激浓度为120μg/ml和240μg/ml时，凋亡细胞占（29.24±3.47%）和（34.64±7.51%），WSPM2.5刺激浓度为48μg/ml和96μg/ml时，凋亡细胞所占比例为（23.57±6.05%）和（23.09±12.37%），与对照组（14.00±2.92%）相比凋亡细胞明显增加。（p＜0.05）　　2.PM2.5对人支气管平滑肌细胞迁移的影响:TAPM2.5(15μg/ml)和WSPM2.5(3μg/ml)刺激后，人支气管平滑肌细胞迁移细胞数为(182.3±82.5)和(225.8±96.1)，与对照组(27.2±16.3)比较迁移的细胞数增加（p＜0.05）；WSPM2.5刺激下迁移的细胞数比TAPM2.5刺激更多，P＞0.05，二者无统计学意义。　　3.PM2.5对人支气管平滑肌细胞分泌的影响：TAPM2.5(30μg/ml)及WSPM2.5(6μg/ml)均能明显促进IL-6、IL-8、IL-10、IL12、MACF、VEGF、MMP2、TGF-β1等因子呈时间依赖性的分泌增加(P＜0.05)。　　4.Shh通路对PM2.5引起的人支气管平滑肌细胞迁移和分泌的影响：　　a.PM2.5对人支气管平滑肌细胞Shh通路的影响：TAPM2.5(15μg/ml)及WSPM2.5(3μg/ml)引起HBSMCs中Shh、Gli1、Snail呈时间依赖性表达，应用Shh通路抑制剂Cyclopamine或siGli1可使PM2.5引起的增强效应减弱。　　b.Shh通路参与PM2.5引起的人支气管平滑肌细胞的迁移：不同浓度重组Shh蛋白(0、10、100、1000ng/ml)刺激HBSMCs6h，迁移细胞数分别为(52.1±32.3)、(64.7±20.8)、(166.9±38.9)、(218.8±52.1)，重组Shh蛋白呈浓度依赖性促进HBSMCs迁移；给予Cyclopamine预处理后再用TAPM2.5(15μg/ml)和WSPM2.5(3μg/ml)刺激时，迁移的细胞数分别为(103.5±36.6)、(105.0±24.0)，较TAPM2.5和WSPM2.5刺激时的(319.0±86.3)和(295.4±44.6)减少；siGli1+TAPM2.5、siGli1+WSPM2.5、siSnail+TAPM2.5、siSnail+WSPM2.5组迁移的细胞数分别为(42.5±18.4)、(54.3±3.3)、(44.9±3.2)、(34.7±4.4)，较NC+TAPM2.5和NC+WSPM2.5刺激(193.7±57.4)、(199.7±59.6)均明显减少。说明Shh通路能够介导PM2.5诱发的HBSMCs迁移。　　b.PM2.5通过Shh通路促进人支气管平滑肌细胞分泌：　　重组Shh蛋白、Cyclopamine对HBSMCs分泌影响：实验分为对照组、重组Shh蛋白、重组Shh蛋白+Cyclopamine、TAPM2.5、TAPM2.5+Cyclopamine、WSPM2.5、WSPM2.5+Cyclopamine刺激组，IL-8分泌量(pg/ml)分别为(25.3±6.1)、(39.3±7.7)、(26.7±10.5)、(27.8±2.5)、(17.89±3.9)、(36.7±6.0)、(25.8±3.4)；MCAF分泌量（pg/ml）为(21.5±4.5)、(29.3±5.8)、(18.0±3.2)、(16.6±4.8)、(10.6±2.0)、(29.8±6.1)、(17.3±1.1)。发现重组Shh蛋白促进HBSMCs分泌IL-8、MCAF，TAPM2.5及WSPM2.5刺激同时给予Cyclopamine预处理，与PM2.5刺激比较IL-8、MACF分泌减少。　　沉默Gli1或Snail对HBSMCs分泌的影响：实验分为NC组、NC+TAPM2.5组、NC+WSPM2.5组、siGli1组、siGli1+TAPM2.5组、siGli1+WSPM2.5组、siSnail组、siSnail+TAPM2.5组、siSnail+WSPM2.5组，IL-8分泌量（pg/ml）为(225.7±110.4)、(510.4±282.4)、(467.5±115.5)、(23.6±17.5)、(31.3±11.4)、(36.2±6.9)、(60.8±40.5)、(135.8±79.4)、(127.9±25.4)，MCAF分泌量（pg/ml）为(147.2±97.0)、(284.8±12.1)、(262.5±44.9)、(27.6±12.4)、(34.9±7.9)、(88.9±59.0)、(31.6±9.3)、(38.2±17.4)、(50.1±11.7)。发现与PM2.5组刺激比较，siGli1+PM2.5及siSnail+PM2.5刺激分泌IL-8、MCAF均减少。以上说明Shh通路参与PM2.5引起的人支气管平滑肌细胞分泌，沉默Snail后IL-8、MCAF分泌量亦明显减少，提示IL-8与MCAF可能与HBSMCs迁移相关，PM2.5可能诱发HBSMCs迁移后分泌更多的IL-8、MCAF，分泌增多的IL-8、MCAF进一步诱发HBSMCs迁移。　　结论：　　WSPM2.5和TAPM2.5均能通过Shh通路促进人支气管平滑肌迁移和分泌。