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【目的】根据WHO报告,每年季节性流感病毒流行给全球国家及地区造成了巨大的社会负担和经济损失。血凝素（Hemagglutinin,HA）是流感病毒重要的表面糖蛋白,具有免疫原性,是流感疫苗诱导宿主应答的关键抗原,可以诱导宿主产生特异性抗体中和流感病毒,进而阻断病毒进入宿主,所以是重组流感疫苗理想的候选抗原。本研究通过中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells,CHO）表达系统稳定表达HA重组蛋白,构建H1N1型流感病毒亚单位疫苗,同时建立了适用于该疫苗的快速定量H1N1型流感病毒HA蛋白的检测方法,并评价了重组蛋白的免疫原性及主动免疫保护效果。【方法】首先通过H1N1型流感病毒灭活疫苗原液免疫家兔制备能够与流感病毒蛋白特异性结合的兔多抗。以兔多抗作为包被抗体,H1N1型流感病毒标准血清作为检测抗体,HRP标记的驴抗绵羊抗体作为酶标抗体建立ELISA双抗夹心法以检测HA蛋白的浓度,并进行方法学验证,然后与单向免疫扩散试验进行比较。以H1N1型流感病毒HA序列为参考序列,确定其胞外段序列,经过密码子优化后进行基因合成,构建重组质粒KS001-HA,经验证正确后电转至CHO细胞,通过抗性筛选得到稳定表达重组蛋白的单克隆细胞株,放大培养并进行细胞传代稳定性分析。通过SDS-PAGE、Western blot及糖基化鉴定重组蛋白rHA。同时进行了rHA蛋白经离子交换柱纯化方法的研究,纯化产物进行纯度及浓度的检测。为了研究rHA蛋白的免疫原性,用不同剂量的rHA蛋白分别辅以4种不同佐剂（Al（OH）3、MA135、HA202、HA203）,在第0,28天经腹腔注射免疫小鼠,通过病毒微量中和试验（Microneutra-lization test,MNT）检测小鼠血清抗体效价,通过酶联免疫斑点测定法（Enzyme-linked immunospot assay,ELISpot）检测加强免疫后5天小鼠脾脏淋巴细胞的分泌IL-4和IFN-γ的细胞水平。根据免疫原性结果,对15μg rHA蛋白组及HA203佐剂配伍组的小鼠进行同源流感病毒的攻毒保护实验,监测并记录攻毒后小鼠临床症状、生存率和体重变化。攻毒后第七天取小鼠肺组织检测其病毒载量,并通过HE染色和免疫组化观察肺组织的病理变化。【结果】通过H1N1型流感病毒疫苗原液制备的兔抗体效价为1562500,抗体纯化后效价为312500,且纯度＞95%。在包被抗体稀释度1:500、检测抗体稀释度1:2000、HRP标记抗体稀释度1:4000条件下方阵滴定法测定的吸光度值P/N值最高,因此将其确定为ELISA双抗夹心法最佳的工作浓度。HA标准抗原浓度在5～80 ng/m L范围内与A450nm值有良好的线性关系,相关系数R~2＞0.99。对高、中、低浓度（60、30、15ng/m L）的标准抗原进行准确度验证,样品回收率分别为102.28%、101.19%、100.52%。重复性验证不同批次间实验样品的变异系数CV不超过10%,且标准曲线的斜率无统计学差异。不同实验人员对同一样品进行重复检测的结果变异系数均小于10%。对于不同浓度H1N1型流感疫苗原液HA含量检测,ELISA双抗夹心法比单向免疫扩散法检测结果略高,但两种检测结果显示有相关性,相关系数R~2为0.99。构建的重组质粒KS001-HA经测序鉴定正确后转染至CHO细胞,经25μmol/L蛋氨酸亚砜酰亚胺（Methionine sulfoximine,MSX）选择性压力筛选出稳定表达HA蛋白的单克隆细胞株。传代稳定性结果显示,10到25代次的单克隆细胞生长趋势一致,细胞密度最高可达1×10~7cells/m L,表达量均在230μg/m L左右,且各代次重组细胞提取的目的基因的DNA序列与理论序列一致。rHA蛋白通过SDS-PAGE实验显示相对分子质量约70000 Da,经PNGase F酶处理后,蛋白大小变为60000 Da。经Capto Q离子交换层析柱纯化蛋白样品,纯化产物纯度检测＞95%。阳性对照H1N1型病毒流感疫苗原液组初次免疫后小鼠血清几何平均滴度（Geometric mean titer,GMT）为571,显著高于rHA蛋白组及其佐剂配伍组。除HA203佐剂配伍组的血清抗体阳转率达90%以上,其他组阳转率较低。加强免疫后除阴性对照组外各组血清抗体阳转率均为100%。随着剂量的增长,各组血清抗体的GMT也随之增长。佐剂配伍组的效价显著高于rHA蛋白组,其中HA203佐剂配伍组（60μg）GMT最高,为12907,HA203佐剂配伍组的15、30、60μg剂量组小鼠血清GMT显著高于阳性对照组GMT,3044。HA203佐剂配伍组和阳性对照组分泌IL-4和IFN-γ的细胞水平与阴性对照组有显著性差异,且HA203佐剂配伍组分泌IFN-γ的细胞水平低于阳性对照组。rHA蛋白组、佐剂对照组、PBS组在攻毒后有50%的小鼠死亡,HA203佐剂配伍组和阳性对照组无小鼠死亡,且体重在攻毒后第三天开始恢复。佐剂配伍组与阳性对照组病毒载量结果无统计学差异,其肺组织肺泡结构清晰,仅见肺泡壁轻度增厚,伴少量的炎性细胞浸润,组化实验仅检测到少量呈灶性分布的棕黄色颗粒。而其他组的肺组织病变明显,可见大范围实质化,肺泡结构不清,伴大量的炎性细胞浸润等病理性改变,组化实验检测到棕黄色颗粒呈弥漫性分布,主要分布于肺泡上皮细胞胞质和支气管腔中。【结论】本研究建立并验证了一种定量检测HA蛋白的ELISA双抗体夹心法,该方法准确度和重复性及中间精密度良好,可以用于HA蛋白的检测,且为后续重组蛋白rHA的快速、高通量检测提供了技术支持。成功构建了重组质粒KS001-HA,于CHO细胞中表达,并筛选出稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株,该细胞株在10代到25代之间传代及遗传稳定性良好。rHA蛋白以单体形式存在且糖基化丰富。rHA蛋白独自作用小鼠产生的免疫原性较低且不能保护小鼠抵抗H1N1型流感病毒的攻击,rHA蛋白联合佐剂免疫小鼠后具有较好的免疫原性,HA203佐剂的免疫增强效果最好。rHA蛋白配伍HA203佐剂可以诱导小鼠产生特异性体液免疫保护小鼠抵御H1N1型流感病毒的攻击,可以减少炎性细胞浸润,有效抑制病毒的复制,减少肺组织的病理性改变。