拟南芥CRL和ATHB17蛋白的结构和功能研究

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本文第一部分内容是拟南芥CRL蛋白的结构和功能研究。  拟南芥CRL(CRUMPLED LEAF)蛋白定位于叶绿体外膜,其突变体植株叶绿体的分裂和细胞周期过程均受到抑制。CRL蛋白所包含的CpeT/CpcT结构域在蓝藻中编码藻胆蛋白裂合酶,可以催化藻胆色素和藻胆蛋白的共价连接。藻胆蛋白进一步组装成藻胆体,在蓝藻中起捕光复合体的作用。拟南芥中并不含有藻胆体,其捕光功能也被光系统取代。因此,CRL蛋白的功能在进化过程中很可能发生了变化,其生化功能有待进一步研究。我们合作实验室的研究结果表明CRL蛋白还可以定位于线粒体外膜,其突变体植株的线粒体分裂过程也受到抑制。BiFC和Co-IP实验结果则表明CRL蛋白可以与Toc33/34和Tric1/2相互作用。Toc33/34是叶绿体外膜蛋白转运机器TOC复合物的组分之一,可以结合叶绿体蛋白质前体的转移肽区域,起始蛋白质转运。Tric1和Tric2则定位于叶绿体内膜和线粒体外膜,对于线粒体tRNA的转运是必需的。因此,CRL蛋白可能也参与了叶绿体和线粒体蛋白或tRNA的转运过程。  本文的研究目的是解析CRL蛋白片段的晶体结构,通过结构分析比对为CRL蛋白的生化功能研究提供线索。主要内容有:CRL蛋白片段的表达、纯化、结晶,晶体的X射线衍射、衍射数据的收集处理及三维结构的解析。在尝试了多种蛋白片段以后,我们筛选得到了CRL(43-239aa)蛋白的晶体,并通过制备硒代甲硫氨酸衍射物的方法解决了相位问题,收集处理衍射数据后解析了其晶体结构。结构显示一个不对称单位中含有两个蛋白质分子,每个蛋白质分子由反平行β-strands构成的β-barrel结构和若干个α螺旋结构组成。通过结构比对我们发现,CRL的CpeT/CpcT结构域的三维结构与藻类中的藻胆蛋白裂合酶非常相似,其RMSD值约为2.24(A)。  本文的另一部分内容是拟南芥ATHB17蛋白的结构和功能研究。  植物在生长发育过程中总是受到各种非生物逆境的影响。植物光合作用过程对逆境胁迫非常敏感,是容易受到逆境干扰的主要生理过程之一,因此光合作用过程对于逆境的快速响应对于植物抵抗逆境胁迫是非常重要的。  ATHB17蛋白是一种植物HD-ZIP蛋白家族成员的转录因子,可以作为植物抗逆过程中的一个正调控因子,过表达ATHB17蛋白可以增强植物的抗逆能力,athb17突变体则对逆境处理比较敏感。ATHB17蛋白一方面直接结合到许多光合作用相关核基因的启动子区域,下调光合作用相关核基因的表达,减弱捕光过程,避免了光氧化伤害。另一方面,ATHB17可以直接结合到拟南芥sigma因子ATSIG5的启动子区域,通过上调其表达来增强光合系统Ⅱ的修复能力。通过这两方面的作用,最终提高了植物耐受逆境的能力。  本部分研究的目的是解析ATHB17与靶DNA复合物的晶体结构,期望深入理解ATHB17蛋白转录调控的机理。主要内容有ATHB17蛋白片段的表达、纯化、ATHB17-DNA复合物的结晶及X射线衍射。我们设计了多种蛋白质片段,分别进行表达和纯化,并采用凝胶过滤层析的方法鉴定了蛋白与DNA在体外的相互作用。最终,我们获得了ATHB17-DNA复合物高分辨的晶体,为解析其三维结构打下了基础。
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