论文部分内容阅读
目的:乳腺癌是我国女性中最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均处于女性恶性肿瘤的首位,严重危害女性的生命健康。随着医学技术的发展,目前临床上乳腺癌的治疗方法主要包括外科手术治疗、放化疗、内分泌治疗等,虽然在乳腺癌疾病的早期诊断和治疗措施方面得以改善,但未能降低乳腺癌的死亡率。因此,探讨如何提高对乳腺癌的治疗水平具有重要的临床意义。目前,随着间质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)在肿瘤治疗中的潜在价值得到了越来越多研究者的关注,现研究表明MSCs可通过其分泌体参与肿瘤进展和肿瘤微环境的调节。胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是由多种类型的细胞分泌的膜性纳米囊泡,在生理和病理条件下都能介导细胞间的通讯。然而,关于它们相互作用的潜在机制和功能,仍然存在许多未解之谜。本研究旨在探讨人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)来源的EVs(hUCMSC-EVs)对人乳腺癌细胞增殖、迁移的影响及机制研究。方法:(1)从医院取来新鲜的脐带组织,采用组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs,观察hUC-MSCs形态特征;用成骨诱导液和成脂诱导液来鉴定hUC-MSCs的多向分化潜能;流式细胞术鉴定hUC-MSCs的表面标记;(2)差速超速离心法提取hUC-MSC-EVs;透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察hUC-MSC-EVs形态;Nanosight检测hUC-MSC-EVs的粒径分布;流式细胞术和Western blot检测hUC-MSC-EVs表面蛋白CD63、CD81的表达情况;(3)通过免疫荧光观察hUC-MSC-EVs被MCF-7和MDA-MB-231内化过程;(4)通过MTT和平板克隆形成实验检测hUC-MSC-EVs对MCF-7和MDAMB-231两种乳腺癌细胞株的增殖影响;通过划痕实验和Transwell实验检测hUCMSC-EVs对乳腺癌细胞迁移和侵袭作用;利用Western blot检测hUC-MSC-EVs对乳腺癌细胞的p-ERK、N-cadherin、E-cadherin等蛋白的表达情况;(5)通过平板克隆形成实验观察hUC-MSC-EVs对ERK抑制剂U0126处理后的乳腺癌细胞增殖的影响;通过划痕实验和Transwell实验检测hUC-MSCEVs对ERK抑制剂U0126处理后的乳腺癌细胞迁移和侵袭作用;利用Western blot检测hUC-MSC-EVs对ERK抑制剂U0126处理后乳腺癌细胞的p-ERK、Ncadherin、E-cadherin等蛋白的表达情况;结果:(1)经过分离培养,镜下可见细胞形态为长梭形,呈漩涡样生长;通过成骨诱导液诱导14天后,经ALP染色可见红色钙结节;通过成脂诱导液诱导21天后,经油红O染色可见橘红色的脂滴;流式细胞术结果显示CD45、CD19、CD34为阴性表达,而CD105、CD90、CD29为阳性表达,其符合MSCs的一般表面标志;(2)镜下观察hUC-MSC-EVs呈单个或者是成堆聚集分布的膜性纳米级囊泡,呈椭圆或碟状结构,中心低密度,直径在几十到几百不等;通过流式细胞术和Western blot检测hUC-MSC-EVs表面标记发现其表达CD63和CD81,也是符合EVs的一般表面标记;(3)免疫荧光证实了hUC-MSC-EVs可以被MCF-7和MDA-MB-231细胞内化;(4)通过MTT和平板克隆形成实验以及划痕实验和Transwell实验结果显示,hUC-MSC-EVs处理后的MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增强;而加入ERK抑制剂U0126后,乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力下降;(5)Western blot结果显示随着hUC-MSC-EVs浓度的增加,p-ERK表达增加,E-cadherin表达降低,N-cadherin表达增加;而加入ERK抑制剂U0126后,p-ERK表达减少,E-cadherin表达增加,N-cadherin表达降低。结论:hUC-MSC-EVs通过ERK途径诱导EMT促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移潜能,从而导致恶性肿瘤进展和转移。这项研究提示,针对逆转EMT的途径可能会开发新的治疗方法来对抗乳腺癌。