创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI),是神经外科常见的一种急重症,其发生率无论平时还是战时都非常高,死亡率及致残率均高居各类创伤首位。除了原发性脑损伤引起的脑组织结构破坏,包括神经炎症反应、自由基堆积、兴奋性氨基酸中毒、线粒体功能障碍、钙超载等继发性脑损伤显著影响TBI神经损伤程度。动物实验研究表明神经炎症反应在TBI急性期迅速发生,并能持续很长一段时间,在TBI继发性脑损伤中发挥重要的双刃剑作用。目前大多数学者认为,脑损伤急性期过度的神经炎症反应不利于神经细胞尤其是神经元的存活及修复,导致神经细胞及组织损伤加重。因此对TBI急性期损伤脑区过度炎症反应的有效调控成为干预TBI神经损伤的一条重要策略。在单核巨噬细胞等外周循环中的免疫细胞通过遭受破坏的血脑屏障进入损伤脑组织引起神经组织炎症反应的同时,同属于单核巨噬细胞系的神经系统原位的免疫细胞——小胶质细胞在损伤细胞释放的多种内源性刺激物的刺激下,出现阿米巴样形态改变,可以吞噬清除坏死的神经细胞碎片,还可释放多种炎症因子、趋化因子等,广泛参与诱导、调节神经免疫反应。既往研究报道小胶质细胞胞膜广泛表达Toll样受体(toll like receptors,TLRs)。TLRs能识别细菌、病毒、真菌等表达的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs),引发固有免疫反应,在病原体感染性疾病中发挥重要作用。近年来,研究者发现TLRs还广泛参与细胞损伤后产生释放的蛋白、多肽、核酸等内源性的危险相关分子模式(danger-associated molecular pattern,DAMPs)的识别及免疫信号的转导,启动非感染性的固有免疫反应。其中TLR4亚型是目前神经系统固有免疫研究的热点,其信号转导途径包括MyD88依赖和非依赖两条途径。在MyD88依赖的信号途径中,TLR4接受的胞外信号通过MyD88分子经下游的白介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor associated kinases,IRAK)、转化生长因子β激酶1(transforming growth factor-βactivated kinase 1,TAK1)等分子向下进行转导,引起核因子-κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-κB,IκB)磷酸化降解,导致NF-κB(尤其是p65亚单位)从细胞质转移至细胞核,启动各类炎症因子的基因转录及蛋白合成,积极参与到神经免疫炎症反应中。祖国医学博大精深,是我们医学研究者取之不尽、用之不竭的巨大宝库。其中,姜科姜黄属植物姜黄是天然抗氧化、抗炎中草药,在我国传统医学及印度医学中已经有数千年的应用历史,姜黄素就是从其根茎提纯出来的一种有效活性成分。现代医学研究证实姜黄素具有强大的抗炎作用,能促进炎症损伤组织的修复。近年来已开始逐渐深入到各类神经系统损伤的相关研究中,虽有零星报道观察到姜黄素对tbi神经损伤有明显保护作用,但机制不清,尤其是姜黄素对tbi急性期神经炎症的调控作用及其可能调节机制存在大量未知。我们推测姜黄素的神经炎症调控作用可能通过影响小胶质细胞的形态和功能来实现。基于此,本课题研究采用免疫组织化学、免疫印迹、细胞共培养、酶联免疫吸附检测、fjb及tunel染色等技术方法,首先对比检测了野生型和tlr4基因敲除(tlr4-/-)型小鼠tbi急性期24h时神经功能及神经元损伤情况,以及损伤脑组织炎症因子含量,为明确tlr4调控tbi急性期神经炎症反应进而影响神经元死亡及神经功能提供有利证据;然后采取tbi后腹腔注射姜黄素处理,同样观察24h时神经损伤及损伤区神经炎症的变化情况,以及tlr4在胶质细胞内的表达情况和tlr4通路信号分子的表达变化,揭示tlr4在姜黄素减轻tbi急性期过度神经炎症中的可能作用;最后利用体外原代小胶质细胞与神经元细胞共培养方式,予脂多糖及姜黄素处理,观察小胶质细胞的形态、胞膜tlr4表达、炎症因子分泌的变化对神经元细胞损伤的影响,以及小胶质细胞tlr4通路信号分子的表达变化情况,证实姜黄素能通过调控小胶质细胞tlr4表达而抑制小胶质细胞的过度活化,进而减轻神经元炎性损伤,并对其可能的信号通路进行了初步研究,主要结果如下:1.所有实验小鼠于tbi后2h左右能完全苏醒,清醒后其一般活动与进食行为均减弱。术后24h头部切口愈合良,未发生感染现象及动物死亡,术后存活率达百分之百。2.创伤侧脑组织tlr4表达于tbi后6h可见明显升高,后继续逐渐升高直至24h达到顶峰。之后tlr4表达开始下降,于72h时tlr4表达仍显著高于0h。3.tbi后24h,野生型及tlr4-/-型小鼠神经功能缺损及脑水肿明显,但tlr4-/-型小鼠的神经功能评分及脑组织含水量显著低于野生型。野生型及tlr4-/-型小鼠创伤周围脑组织可见大量tunel阳性、fjb阳性细胞,tlr4-/-小鼠tunel阳性细胞与dapi阳性细胞之百分比、fjb阳性细胞数目均显著低于野生型小鼠。4.与各自假手术组比较,tbi后24h野生型及tlr4-/-型小鼠创伤周围脑组织中il-1β、il-6、mcp-1、rantes等炎症因子含量显著增多,但tlr4-/-组的各炎症因子含量均显著低于野生组。5.tbi后15min腹腔注射不同浓度的姜黄素,100mg/kg浓度姜黄素处理的小鼠创伤脑组织tlr4蛋白表达显著低于未给药组及50mg/kg浓度组。而200mg/kg浓度组的创伤脑组织tlr4蛋白表达也较未给药组明显降低,但与100mg/kg浓度组比较则无显著差异。6.tbi后24h,100mg/kg姜黄素处理组小鼠的神经功能障碍评分及脑组织含水量显著低于对照剂处理组。姜黄素处理组小鼠tunel阳性细胞与dapi阳性细胞之百分比、fjb阳性细胞数目均显著低于对照剂处理组。7.与各自假手术组比较,tbi后24h姜黄素处理组及对照剂处理组小鼠创伤周围脑组织中il-1β、tnf-α、mcp-1、rantes等炎症因子含量显著增多,但姜黄素处理组的各炎症因子含量均显著低于对照剂处理组。8.tbi后24h,创伤后予对照剂或姜黄素处理组小鼠创伤周围脑组织均可见大量tlr4与cd11b阳性共表达的小胶质/巨噬细胞,同时tlr4免疫阳性强。而这些cd11b阳性细胞,胞体明显变大,突起也变粗变短。但姜黄素处理组的tlr4阳性小胶质/巨噬细胞数目显著低于对照剂处理组。9.与各自假手术组比较,创伤后予对照剂及姜黄素组小鼠创伤周围脑组织tlr4、myd88、p-iκb-α,nf-κb等蛋白表达明显上调,但姜黄素处理组的tlr4、myd88、p-iκb-α,nf-κb等蛋白表达均显著低于对照剂组。而两创伤组脑组织iκb-α的蛋白表达则较两假手术组均明显下调,但创伤后给予姜黄素组的脑组织iκb-α蛋白表达显著高于给予对照剂组。10.0.5μm,1μm,2μm及5μm浓度的姜黄素对元代培养的小胶质细胞活力无明显影响,而10μm浓度姜黄素则显著降低小胶质细胞活性;而5μm及10μm浓度姜黄素均显著降低原代培养神经元细胞活性。故本部分实验选择最佳浓度2μm姜黄素对共培养细胞进行处理。11.单独神经元培养中,脂多糖(lps)刺激后神经元的胞体明显变小,突起也大量减少,不能形成网状结构;而经姜黄素处理后,其形态破坏与对照剂处理组相比略有改善,但改善程度并不十分明显。在神经元与小胶质细胞共培养系统中,lps刺激后神经元的形态破坏程度较单培养组更严重;而予姜黄素处理后,共培养的神经元形态破坏得以明显改善。12.单独神经元培养中,lps刺激后神经元的caspase3表达明显上调;而经姜黄素处理后,caspase3表达无明显差异。在神经元与小胶质细胞共培养系统中,LPS刺激后神经元的caspase3表达较单培养组显著增多;而予姜黄素处理后,共培养的神经元caspase3表达则显著下降。13.经LPS刺激后,可见大量TLR4与CD11b阳性共表达的小胶质细胞,同时表达的TLR4免疫阳性较强,而这些小胶质细胞与对照组相比,胞体明显变大,突起也变粗变短;予姜黄素处理后,小胶质细胞虽仍可见大量TLR4与CD11b共表达,但TLR4免疫荧光强度显著降低,且细胞胞体变大及突起变短变粗的程度明显缓解。14.LPS刺激共培养细胞,24h时IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、RANTES浓度显著升高,经姜黄素处理组的IL-1β、IL-6、RANTES浓度显著低于对照剂处理组。15.LPS刺激后小胶质细胞内TLR4及其下游分子MyD88、p-IκB-α,NF-κB等蛋白表达显著上调,IκB-α的蛋白表达显著下调,但姜黄素处理后的TLR4、MyD88、p-IκB-α,NF-κB等蛋白表达的上调程度显著降低,IκB-α蛋白表达的下调程度也显著降低。主要结论:1.TLR4在创伤性脑损伤继发急性炎症中发挥重要作用。2.姜黄素减轻TBI急性炎症损伤的机制之一就是对小胶质细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的有力调控。本课题初步阐明了急性期神经炎症反应对TBI神经损伤的影响,进一步揭示了TLR4对急性期神经炎症及神经损伤的调控作用,为探索TBI治疗的新药物及靶点提供了重要依据。而且,本课题证明姜黄素(中草药姜黄的有效成分提取物)对TBI急性期神经损伤的改善作用至少部分是通过调节小胶质细胞TLR4信号通路抑制过度的神经炎症反应来实现的,拓展了姜黄素的治疗范围,也为深入探究姜黄素治疗TBI的可能药理机制提供了实验基础。