乳品掺假现象的发生已经对消费者的健康与安全形成危害，造成公共卫生问题。本研究通过对抗原-酪蛋白的分离提取及免疫，获得兔抗牛β-酪蛋白血清抗体；并进一步研究抗体修饰技术对血清抗体的影响，建立定量检测牛β-酪蛋白以及羊乳中掺入牛乳成分的免疫学方法。实验内容如下： 1、兔抗牛β-酪蛋白血清抗体制备与特性研究 牛β-酪蛋白抗原制备。采用尿素沉淀法从干酪素中分离β-酪蛋白作为抗原，获得的β-酪蛋白(bovineβ-casein)，纯度为90.1％，得率为26.4％(w/w)。加入福氏佐剂作为免疫原。 血清抗体的制备。免疫新西兰白兔，免疫五次后，采用颈动脉放血法收集血液，经4℃，4小时放置后，采集免疫血清。经间接ELISA方法检测免疫血清的效价为1:10240。 通过饱和硫酸铵分级沉淀法纯化免疫血清，得到兔抗牛β-酪蛋白血清抗体(IgGanti-bovineβ-casein，anti-BC)，其纯度为84.2％。 血清抗体的特性。通过间接ELISA分析，研究牛乳中常见的乳清蛋白、αs-、κ-酪蛋白和β-酪蛋白抗原与anti-BC的反应特性，按亲和力大小排序β-酪蛋白＞αs-酪蛋白＞κ-酪蛋白＞乳清蛋白。 2、抗体修饰技术的研究 血清抗体先经过DEAE-SephadexA-50离子交换色谱纯化，再通过抗体修饰技术(rendering)：将兔抗牛β-酪蛋白血清抗体(2.24mg/mL)和羊乳β-酪蛋白(2mg/mL)等体积混合于37℃培养2h，旨在消除血清抗体中可以与羊乳β-酪蛋白产生交叉反应的抗体(又称抗体堵住blocking)，以提高血清抗体的免疫反应特异性。交叉反应的抗体抗原(羊乳β-酪蛋白)复合物在后续的ELISA洗涤步骤中被去除。 采用间接ELISA通过抗原抗体的剂量反应曲线比较修饰前后抗体的免疫反应特异性，分别以脱脂牛乳、羊乳(均按1:23～1:211梯度稀释)为包被抗原，修饰前后的抗体(anti-BC和blockedanti-BC)稀释倍数为1:40。 结果显示，当抗原稀释倍数在1:23～1:28的范围内时，特别是当抗原稀释倍数为1:24时，anti-BC与脱脂羊乳的反应值是blockedanti-BC与脱脂羊乳反应值的2.50倍，而ami-BC与脱脂牛乳的反应值只是blockedanti-BC与脱脂牛乳反应值的1.01倍。 因此，与anti-BC反应相比，blockedanti-BC对羊乳的亲和力明显降低，而抗体经修饰处理前后，对于牛乳的亲和力差别不大。当抗原稀释倍数在1：23～1:28的范围内时，blockedanti-BC能够有效地将牛乳与羊乳区分开来。采用抗体修饰技术有效地封堵了血清抗体中与羊乳β-酪蛋白交叉反应的抗体组分，提高了免疫反应的专一性。为建立免疫学检测羊乳中掺入牛乳成分的研究奠定了基础。 3、间接ELISA检测牛β-酪蛋白的方法建立及应用。 通过棋盘滴定法，确定了β-酪蛋白抗原包被浓度1.25μg/mL，血清抗体(anti-BC)的最佳工作浓度1:1280，酶标二抗的工作浓度1:1000。建立的间接ELISA检测牛β-酪蛋白的线性范围是25～2500ng/mL，相关系数0.9663，变异系数(CV)小于5％，回收率在93.5％～127.0％。 证明所建立的间接ELISA检测牛β-酪蛋白方法的重复性和准确度均能满足检测要求，并且方便易行：可以通过β-酪蛋白与牛乳中总蛋白质的关系，用于牛乳及其产品的牛乳源性蛋白质的快速免疫方法检测，作为质量控制的重要指标。 4、免疫学检测羊乳中掺入牛乳含量的研究 优化了间接ELISA的检测条件：包被脱脂牛乳、牛乳酪蛋白以及灭菌乳稀释倍数1:128，1:32，1:128；分别加入经抗体修饰技术处理后的抗体(blockedanti-BC)，稀释度分别为：1:160，1:80，1:160，酶标二抗的工作浓度1:1000。 建立了检测羊乳样品中掺入牛乳成分含量的间接ELISA方法。样品为脱脂乳及灭菌乳的检测线性范围是2～50％(羊乳中掺入牛乳的质量分数,V/V)，相关系数是0.999，最低检出量4％；样品为乳酪蛋白的检测线性范围2～50％(w/w)，相关系数是0.98，最低检出量3.5％。变异系数(CV)均小于5％。实验所建立的间接ELISA检测羊乳样品中掺入牛乳成分含量方法，具有特异性强、敏感性高、操作便易等特点，可以用于针对羊乳中是否掺入牛乳、乳酪蛋白以及灭菌乳的快速检测。 本课题从牛β-酪蛋白抗原制备开始，完成了兔抗牛β-酪蛋白血清抗体的制备及特异性分析、抗体修饰技术对血清抗体影响的研究，建立了定量检测牛β-酪蛋白以及羊乳中掺入牛乳成分的两种间接ELISA方法，为乳品掺假检测提供了技术手段，为乳制产品提供质量保障。