【摘 要】
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长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核酸且不编码蛋白质的RNA。尽管lncRNA被报道参与了诸多生物学过程,其生物学意义和分子机制仍不十分清晰,并
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长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核酸且不编码蛋白质的RNA。尽管lncRNA被报道参与了诸多生物学过程,其生物学意义和分子机制仍不十分清晰,并且存在诸多争议。反向遗传学技术是揭示lncRNA生物学功能的重要研究手段,然而众多相关研究表明现有的研究技术通常具有较高的非特异性作用和脱靶效应,或无法准确判断表型变化是否由转录本导致。除了技术上的限制,lncRNA本身特征,如与功能元件重叠、尚不明确的作用机制、可变剪切、核定位和丰度低等,都使其功能研究充满挑战。本课题研究一类新型lncRNA,极长基因间非编码RNA(very long intergenic non-coding RNAs,vlincRNAs),应用最新的反向遗传学技术CRISPR/Cas13系统,对vlincRNA进行功能鉴定。该方法具有比其他现有方法(如RNAi)更高的特异性,并且靶向RNA而非DNA(如CRISPR/Cas9系统),于是可以准确地将表型分配给转录本。生存筛选是指抗癌药物作用于癌细胞造成压力使细胞伤亡或存活的过程。本课题将CRISPR/Cas13系统与生存筛选结合,构建一套高通量筛选策略,可用以研究vlincRNA以及其他任何RNA(编码或非编码)的生物学功能。在此策略中,我们设计多重对照,以确保准确地鉴别引起表型变化的转录本。利用此系统,我们发现备选转录本中,60%的mRNA和64%的vlincRNA在癌细胞应答抗癌药物的过程中促进细胞生存。综上,本课题证明了基于CRISPR/Cas13系统的高通量生存筛选可以用于mRNA和lncRNA的反向遗传学研究,我们运用此方法,提供了支持vlincRNA生物学意义的证据。
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