第一部分骨髓基质干细胞(MSC)的获取、鉴定及多向分化能力的研究目的:探讨骨髓基质干细胞MSC(bone marrow stromal cells,MSC)的多向分化及组织修复能力。方法:从C57小鼠股骨和胫骨骨髓组织中分离培养MSC,扩增后流式鉴定其表面分子标记,并鉴定MSC向骨、脂肪、软骨及内皮细胞的多向分化能力。体内移植MSC修复ApoE基因敲除小鼠下肢缺血模型,观察移植的MSC在体内向内皮细胞的转归情况,并检测新生内皮细胞的表型、标志蛋白(CD31)表达及再生内皮细胞功能等的差异。结果:从小鼠的骨髓组织中可以获取大量的MSC,当MSC长至P3代时,其形态类似成纤维细胞样,长梭形。流式细胞仪分析显示第3代MSC高表达干细胞特异性分子标记CD29、CD90和CD105,而不表达造血细胞分子标记CD34和CD133,内皮细胞特异性标记CD31及免疫源性指标MHC-II为阴性。细胞增殖CCK8检测结果显示:接种后第1天时MSC生长相对平缓,处在生长潜伏期,从第2-6天起MSC生长迅速,表现为较高的增殖活性。MSC经过诱导后,具有向骨、脂肪、软骨及内皮细胞的多向分化能力。在移植术后第21天时取小鼠下肢缺血肌肉组织切片行免疫组化CD31染色,证实MSC治疗组相对于假手术组、PBS对照组,缺血肌肉组织内可见大量棕色的CD31染色阳性的新生血管,统计学显示存在明显的差异,说明MSC可向缺血的肌肉进一步迁移并进一步转化为新生的CD31阳性的小血管。结论:从小鼠骨髓中可以获取具有多向分化能力的MSC,MSC可以在缺血的肌肉组织内存活、迁移以及向新生血管分化。第二部分建立Hsp70过表达MSC的体系及体内移植治疗小鼠下肢缺血的研究目的:探讨骨髓基质干细胞过表达Hsp70(热休克蛋白70,Heat shock protein70)对提高骨髓基质干细胞增殖、迁移及移植后促进缺血下肢血供改善的效果。方法:通过慢病毒转染等技术,使骨髓基质干细胞过表达Hsp70。CCK8检测转染及未转染Hsp70的骨髓基质干细胞细胞增殖,并比较向骨、脂肪多向分化能力的差异;建立小鼠下肢缺血模型,体内移植转染及未转染Hsp70的骨髓基质干细胞修复下肢缺血并通过免疫组化和免疫荧光技术观察其在体内的存活、迁移和转归情况。结果:成功将Hsp70基因经慢病毒转染入骨髓基质干细胞。免疫荧光染色发现经Hsp70转染后,骨髓基质干细胞不仅表达GFP基因同时高表达Hsp70基因,免疫印迹试验进一步证实转染后骨髓基质干细胞高表达Hsp70蛋白,且经统计学检测P小于0.05。细胞增殖CCK8检测结果显示,接种后第1天时骨髓基质干细胞生长相对平缓,但从第2天起骨髓基质干细胞生长迅速,Hsp70转染组与未转染组均表现为增殖活性提高,统计学检测无明显差异,说明慢病毒转染对骨髓基质干细胞的增殖无明显影响。向骨细胞诱导、成脂肪细胞诱导3周后,发现Hsp70转染组诱导的细胞数量均明显高于与未转染组,经统计学检测P小于0.05。应用激光彩色血流多普勒观察干细胞移植后7天、14天、21天,PBS对照组、骨髓基质干细胞移植组及Hsp70转染的骨髓基质干细胞移植组,经治疗后下肢缺血的血流信号改变,结果显示,随着时间的延长,Hsp70转染组及未转染组缺血下肢血流信号明显高于PBS对照组,且Hsp70转染组的血流灌注比率上升幅度明显强于未转染组及PBS空白对照组(P<0.05)(细胞移植后7天即有明显差异)。免疫荧光染色后,可以发现移植的干细胞呈现绿色的荧光,且GFP阳性的细胞聚集在缺血损伤组织周边处,且这些GFP阳性的细胞同时表达内皮细胞的特异性标记CD31。统计学检测发现Hsp70转染组下肢缺血处新生血管的密度明显高于未转染组、PBS对照组。经过免疫组化染色可以证实新生的小血管同时表达血管内皮细胞的特异性标记vWF。统计学检测证实Hsp70转染组血管内皮细胞的特异性标记物vWF密度明显高于未转染组及PBS对照组。对各大脏器的HE染色进一步证实,经H-骨髓基质干细胞体内移植后不会影响心脏、小肠、肝脏、脾脏及肾脏的形态。结论:能够通过慢病毒转染的方式,使骨髓基质干细胞过表达Hsp70;Hsp70能够促进骨髓基质干细胞在体内外的增生及缺血肢体血管新生;H-骨髓基质干细胞体内移植后不会影响重要脏器形态及生物学功能。第三部分H-MSC促进缺血下肢血管新生的分子机制研究目的:探讨Hsp70促进MSC迁移、粘附、存活及促进缺血下肢血管新生的分子机制。方法:应用Transwell迁移实验、细胞粘附率检测、流式凋亡检测、Western Blot、ELISA等分子生物学手段检测与Hsp70调控相关信号通路及旁分泌因子的变化,阐明其分子机制。结果:Transwell小室检测转染及未转染Hsp70的MSC迁移情况,发现转染Hsp70的MSC可以明显的促进MSC迁移,差异具有统计学意义。粘附实验证实转染Hsp70的MSC可以明显促进MSC粘附,差异具有统计学意义。流式AnnexinV检测低氧及正常培养环境下Hsp70对MSC凋亡的影响,发现经Hsp70基因转染的MSC(6.6%±0.72)与未转染组(22.6%±0.86)相比可以明显减少MSC在低氧条件下的凋亡。凋亡相关基因Bcl-2(抑制凋亡)/Bax(促进凋亡)在经Hsp70基因转染的MSC组(58.6%±0.39)与未转染组(17.3%±0.52)相比,可以明显减少MSC在低氧条件下凋亡,差异具有统计学意义。Westernblot观察到凋亡相关基因Bax出现下调,而抑制凋亡相关基因Bcl-2出现上调,说明Hsp70可以减少在低氧条件下MSC凋亡。WB等检测增殖及迁移相关基因的表达,发现H-MSC组在正常及低氧培养条件下,随着Hsp70剂量的增加,PI3K及Akt表达上调,WB检测亦发现与粘附相关联的FAK及PI3K信号通路的磷酸化增强,应用si RNA信号通路阻滞剂后发现经干扰后FAK/Akt/PI3K/的表达降低。Elisa检测发现H-MSC所分泌的FGF-2、HGF、VEGF及IGF等因子的含量升高,且统计学检测发现Hsp70转染组分泌因子的含量明显高于未转染组,差异具有统计学意义。结论:Hsp70通过Bax/Bcl-2/FAK/PI3K/Akt等信号通路及旁分泌机制促进MSC的存活、迁移及促进缺血肢体血管新生。