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研究背景:
心血管相关疾病有着极高的发病率与死亡率，急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI）属于其急危重症。GATA结合蛋白5(GATA binding protein5，GATA5)是GATA家族的重要成员，通过不同通路参与高血压、房颤、先天性心脏病等心血管相关疾病的发生发展[1-4]。另外，GATA5参与调控细胞代谢[5，6]、冠状动脉发育[7-9]、血管炎症、氧化应激和内皮功能[3，10]等多个AMI相关的病理生理过程。因此，GATA5功能缺陷可增加人群的AMI易感性。
研究目的:
基于GATA5基因启动子在AMI患者中的遗传与功能变异信息进行分子遗传学研究，以探索GATA5基因启动子突变在AMI发生发展中的作用及其调控机制，有望为AMI的预防、诊断、治疗和发病机制研究提供新的遗传学依据。
研究方法:
1、遵循纳入一排除标准，共计683例参与者被纳入本次研究，其中AMI患者332例。采集所有参与者3 ml空腹外周血并从中提取基因组。
2、参考NCBI中GATA5基因启动子序列设计聚合酶链式反应(PCR)引物，体外扩增目的片段后采用Sanger测序法确定变异位点。
3、采用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)、SPSS等在线程序及统计学软件，分析AMI与GATA5启动子单核苷酸多态性(SNP)间的相关性。
4、利用TRANSFAC在线预测软件(https://portal.genexplain.com/)预测受上诉变异位点影响的转录因子。
5、采用瞬时转染的实验方法，以pGL3与pRL-TK为被转染载体，以HEK-293和H9c2为被转染细胞，用以明确GATA5启动子变异位点对其生物学活性的影响。
6、凝胶迁移率变异实验(EMSA)用于检测各突变位点是否干扰某个（些）转录因子与GATA5基因启动子的结合，并应用转录因子特异性抗体确定受变异位点影响的转录因子。
研究结果:
1、在683例参与者GATA5基因启动子中，共发现9个变异位点。其中3个新的杂合突变(g.62476323-24GG＞AA, g.62476197G＞A和g.62476046G＞A)和3个SNPs[g.62476171C＞T(rs1341970027), g.62476123A＞G(rs1435326263)和g.62475977 C＞G(rs1294169077)]在5例AMI患者中被发现。另外3个SNPs[g.62476317G＞A(rs80197101). g.62476223C＞T(rs77067995)和g.6247627IA＞C(rs145936691)]在两组人群中均可被发现，值得注意的是，g.62476317G＞A(rs80197101)和g.62476223C＞T(rs77067995)在42例AMI患者和25例对照者中被发现(X2=6.459, P=0.040; X2=6.459,P=0.040)，而g.62476271 A＞C(rs145936691)在两组中的分布相似(P＞0.040)。
2、Hardy-Weinberg平衡检验显示rs80197101和rs77067995符合Hardy-Weinberg平衡(AMI组:P=0.722, P=0.722;健康对照组:P=0.489, P=0.489)，说明我们纳入的样本具有良好的代表性，且来自于遗传平衡的群体。卡方分析显示rs80197101的“A”和rs77067995的“T”在AMI组分布更高(X2=6.128, P=0.013;X2=6.128, P=0.013);Logistic分析示，校正各混杂因素后，rs80197101“GA”和“GA+AA”依然与AMI相关(OR=2.263,95％CI:1.009～5.079, P=0.048; OR=2.297,95％CI:1.028～5.135, P=0.043),rs77067995“CT”和“CT+TT”也依然与AMI相关(OR=2.263,95％CI:1.009～5.079,P=0.048; OR=2.297,95％CI:1.028～5.135, P=0.043);连锁分析示rs80197101. rs77067995呈完美连锁不平衡(D=1.000, r2=1.000);单倍型分析示rs80197101. rs77067995形成的“AT"在AMI组的分布更高(OR=1.875,95％CI:1.132-3.106, P=0.013)。
3、TRANSFAC应用程序预测受突变所干扰的某个（些）转录因子，g.62476323-24GG＞AA可能消除了E2F相关因子和AP-2与GATA5启动子相结合的位点;g.62476197G＞A可能改变了ZFP161的结合域:g.62476046G＞A可能改变了AP-2和Kruppel-like factor4(KLF4)的结合域:g.62476171C＞T(rs1341970027)可能消除了LRH-1and Steroidogenic factor-1(SF-1) group的结合域，创建了transcription factor7(TCF7)相关因子的结合域;g.62476123A＞G(rs1435326263)新增了BEN的结合域;g.62475977C＞G(rs1294169077)可能消除了Nuclear receptor subfamily1 group H member(FXR)的结合域:g.62476317G＞A(rs80197101)可能消除了Kruppel-Iike factor6(KLF6)的结合域;g.62476223C＞T(rs77067995)可能新增了Small mothers against decapentaplegic(SMAD)在GATA5启动子的结合域。
4、HEK-293细胞和H9c2细胞的转染数据均表明，pGL3-62475977G和pGL3-62476046A显著降低了GATA5启动子活性(P＜0.01)，pGL3-62476197A、pGL3-62476123G、pGL3-62476323-24AA、pGL3-g.62476171T和pGL3-62476317A+62476223T显著升高了GATA5启动子活性(P＜0.05)， pGL3-62476271C并没有改变GATA5启动子活性(P＞0.05)。
5、EMSA分析发现，位点g.62476323-24GG＞AA，g.62475977C＞G(rs1294169077)，g.62476317G＞A(rs80197101)，g.62476197G＞A，g.62476223C＞T(rs77067995)均显著改变了某反式作用因子与GATA5启动子的结合，但g.62476046G＞A，g.62476171C＞T(rs1341970027)和g.62476123A＞G(rs1435326263)并未影响其结合。
研究结论:
1、GATA5启动子变异可通过改变反式作用因子（如:E2F related factors、AP-2、FXR、KLF6、SMAD与ZFP161等）与GATA5启动子相应结合域的结合而影响其活性，进而通过改变GATA5表达水平，增加AMI易感性。
2、Rs80197101位点的“A’和rs77067995位点的“T”为AMI的危险性等位基因，两者形成的“AT”为AMI的危险性单倍型。
心血管相关疾病有着极高的发病率与死亡率，急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI）属于其急危重症。GATA结合蛋白5(GATA binding protein5，GATA5)是GATA家族的重要成员，通过不同通路参与高血压、房颤、先天性心脏病等心血管相关疾病的发生发展[1-4]。另外，GATA5参与调控细胞代谢[5，6]、冠状动脉发育[7-9]、血管炎症、氧化应激和内皮功能[3，10]等多个AMI相关的病理生理过程。因此，GATA5功能缺陷可增加人群的AMI易感性。
研究目的:
基于GATA5基因启动子在AMI患者中的遗传与功能变异信息进行分子遗传学研究，以探索GATA5基因启动子突变在AMI发生发展中的作用及其调控机制，有望为AMI的预防、诊断、治疗和发病机制研究提供新的遗传学依据。
研究方法:
1、遵循纳入一排除标准，共计683例参与者被纳入本次研究，其中AMI患者332例。采集所有参与者3 ml空腹外周血并从中提取基因组。
2、参考NCBI中GATA5基因启动子序列设计聚合酶链式反应(PCR)引物，体外扩增目的片段后采用Sanger测序法确定变异位点。
3、采用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)、SPSS等在线程序及统计学软件，分析AMI与GATA5启动子单核苷酸多态性(SNP)间的相关性。
4、利用TRANSFAC在线预测软件(https://portal.genexplain.com/)预测受上诉变异位点影响的转录因子。
5、采用瞬时转染的实验方法，以pGL3与pRL-TK为被转染载体，以HEK-293和H9c2为被转染细胞，用以明确GATA5启动子变异位点对其生物学活性的影响。
6、凝胶迁移率变异实验(EMSA)用于检测各突变位点是否干扰某个（些）转录因子与GATA5基因启动子的结合，并应用转录因子特异性抗体确定受变异位点影响的转录因子。
研究结果:
1、在683例参与者GATA5基因启动子中，共发现9个变异位点。其中3个新的杂合突变(g.62476323-24GG＞AA, g.62476197G＞A和g.62476046G＞A)和3个SNPs[g.62476171C＞T(rs1341970027), g.62476123A＞G(rs1435326263)和g.62475977 C＞G(rs1294169077)]在5例AMI患者中被发现。另外3个SNPs[g.62476317G＞A(rs80197101). g.62476223C＞T(rs77067995)和g.6247627IA＞C(rs145936691)]在两组人群中均可被发现，值得注意的是，g.62476317G＞A(rs80197101)和g.62476223C＞T(rs77067995)在42例AMI患者和25例对照者中被发现(X2=6.459, P=0.040; X2=6.459,P=0.040)，而g.62476271 A＞C(rs145936691)在两组中的分布相似(P＞0.040)。
2、Hardy-Weinberg平衡检验显示rs80197101和rs77067995符合Hardy-Weinberg平衡(AMI组:P=0.722, P=0.722;健康对照组:P=0.489, P=0.489)，说明我们纳入的样本具有良好的代表性，且来自于遗传平衡的群体。卡方分析显示rs80197101的“A”和rs77067995的“T”在AMI组分布更高(X2=6.128, P=0.013;X2=6.128, P=0.013);Logistic分析示，校正各混杂因素后，rs80197101“GA”和“GA+AA”依然与AMI相关(OR=2.263,95％CI:1.009～5.079, P=0.048; OR=2.297,95％CI:1.028～5.135, P=0.043),rs77067995“CT”和“CT+TT”也依然与AMI相关(OR=2.263,95％CI:1.009～5.079,P=0.048; OR=2.297,95％CI:1.028～5.135, P=0.043);连锁分析示rs80197101. rs77067995呈完美连锁不平衡(D=1.000, r2=1.000);单倍型分析示rs80197101. rs77067995形成的“AT"在AMI组的分布更高(OR=1.875,95％CI:1.132-3.106, P=0.013)。
3、TRANSFAC应用程序预测受突变所干扰的某个（些）转录因子，g.62476323-24GG＞AA可能消除了E2F相关因子和AP-2与GATA5启动子相结合的位点;g.62476197G＞A可能改变了ZFP161的结合域:g.62476046G＞A可能改变了AP-2和Kruppel-like factor4(KLF4)的结合域:g.62476171C＞T(rs1341970027)可能消除了LRH-1and Steroidogenic factor-1(SF-1) group的结合域，创建了transcription factor7(TCF7)相关因子的结合域;g.62476123A＞G(rs1435326263)新增了BEN的结合域;g.62475977C＞G(rs1294169077)可能消除了Nuclear receptor subfamily1 group H member(FXR)的结合域:g.62476317G＞A(rs80197101)可能消除了Kruppel-Iike factor6(KLF6)的结合域;g.62476223C＞T(rs77067995)可能新增了Small mothers against decapentaplegic(SMAD)在GATA5启动子的结合域。
4、HEK-293细胞和H9c2细胞的转染数据均表明，pGL3-62475977G和pGL3-62476046A显著降低了GATA5启动子活性(P＜0.01)，pGL3-62476197A、pGL3-62476123G、pGL3-62476323-24AA、pGL3-g.62476171T和pGL3-62476317A+62476223T显著升高了GATA5启动子活性(P＜0.05)， pGL3-62476271C并没有改变GATA5启动子活性(P＞0.05)。
5、EMSA分析发现，位点g.62476323-24GG＞AA，g.62475977C＞G(rs1294169077)，g.62476317G＞A(rs80197101)，g.62476197G＞A，g.62476223C＞T(rs77067995)均显著改变了某反式作用因子与GATA5启动子的结合，但g.62476046G＞A，g.62476171C＞T(rs1341970027)和g.62476123A＞G(rs1435326263)并未影响其结合。
研究结论:
1、GATA5启动子变异可通过改变反式作用因子（如:E2F related factors、AP-2、FXR、KLF6、SMAD与ZFP161等）与GATA5启动子相应结合域的结合而影响其活性，进而通过改变GATA5表达水平，增加AMI易感性。
2、Rs80197101位点的“A’和rs77067995位点的“T”为AMI的危险性等位基因，两者形成的“AT”为AMI的危险性单倍型。