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拟南芥CYP38属于植物亲免蛋白家族中的一种,位于叶绿体类囊体腔中,由核基因At3g01480编码。CYP38前体蛋白N端的前91个氨基酸残基属于前导肽序列,帮助CYP38蛋白进入类囊体腔。CYP38成熟蛋白的三级结构包括两大结构域：由α螺旋构成的N端结构域(92-215氨基酸)和由β折叠片构成的C端亲环素结构域(239-437氨基酸),两个结构域通过中间的酸性loop链(216-238氨基酸)连接。全长CYP38和其N端肽段都不能与叶绿体类囊体中的AtCtpA等蛋白相互作用,但是C端亲环素结构域可以,并且CYP38的N端和C端通过分子内相互作用紧密结合在一起。因此推断全长CYP38的N端可能影响了C端结构域的功能,导致CYP38不能与叶绿体中的蛋白相互作用；当N-端和C-端分开时,C-端亲环素结构域则可以与其底物结合,发挥CYP38的功能；中间的酸性loop链可能对N-端与C-端的相互作用有关键的调节作用。本工作的主要研究内容是,将连接C端和N端的loop链区域的酸性和碱性氨基酸进行点突变,检验loop链区域氨基酸的改变是否可以解除CYP38成熟蛋白N端和C端的分子间作用力,使其可以与叶绿体蛋白AtCtpA发生相互作用。首先,通过聚合酶链反应扩增CYP38成熟肽序列,将它整入原核表达载体pGEX4T.3,构建pGEX4T.3-CYP38载体。再以pGEX4T.3-CYP38重组质粒为模板,通过PCR介导的定点突变技术创建在loop链区带有不同突变的CYP38表达载体。然后在E.coli中表达相应的带有GST标签的融合蛋白,最后提取并纯化各突变蛋白产物。同时构建了pET28a-AtCtpA原核表达载体,在体外提取并纯化蛋白产物,然后用含有His标签的AtCtpA蛋白做bait,通过蛋白Pull-down手段测试诱饵蛋白和突变蛋白之间的相互作用。实验结果显示,全长的CYP38蛋白原本是不能与AtCtpA相互作用的,但是将它中间酸性loop链区域的236赖氨酸(K)和238精氨酸(R)分别突变为丙氨酸(A),谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)后,CYP38就可以在蛋白质Pull-down实验中与AtCtpA发生相互作用；而将loop链中其它的极性氨基酸216天冬氨酸(D),219天冬氨酸(D),224谷氨酸(E),227谷氨酸(E),228谷氨酸(E),230精氨酸(R)突变成丙氨酸(A),CYP38依旧不能和AtCtpA发生相互作用。我们也构建了pGBKT7-CYP38点突变和pGADT7-AtCtpA载体,用酵母双杂交方法检测CYP38突变蛋白和AtCtp A在酵母体内的相互作用。实验结果和蛋白质Pull-down实验吻合,当点突变发生在236赖氨酸(K)和238精氨酸(R)位置时,CYP38蛋白变得可以和AtCtpA发生相互作用,而其它位点的突变不能使全长CYP38和AtCtpA发生作用。我们的蛋白Pull-down实验和酵母双杂交实验说明loop链区域的碱性氨基酸对CYP38蛋白的构象和功能有着非常重要的作用。我们认为loop链区域的两个碱性氨基酸236 K和238 R在CYP38分子中N-端与C-端的打开/闭合过程中有关键的调节作用。在植物体内,236 K和238 R可能感受由叶绿体能量状态变化导致的类囊体腔pH值变化,改变CYP38分子内N-端和C-端的相互作用,从而调节CYP38在活性状态和非活性状态的转换。另外,本工作还构建了pRI101-AN-CYP38点突变载体,pRI101-AN是用来转化植物的双元载体。首先通过定点突变技术创建了含有CYP38前导肽序列的pBS-CYP38点突变重组质粒,再将突变的CYP38目的片段从重组质粒中酶切下来,与pRI101-AN载体连接构建pRI101-AN-CYP38点突变载体。用CYP38点突变重组质粒转化农杆菌GV3101感受态,然后侵染cyp38-1,cyp38-2突变植株。由于时间关系和经验不足,没有完成这部分实验,但为后续观察转基因株系的表型打下良好的基础。