龙眼(Dimocarpus longan Lour.),属于无患子科(Sapindaceae)龙眼属(Dimocarpus Lour.)常绿木本植物,龙眼胚胎发育的研究对于龙眼的生产具有重要的意义。植物体胚发育过程是一个复杂的过程,存在着许多代谢途径和基因调控网络,miRNA作为重要的调控因子植物体胚发生过程中一定存在着巨大的作用,与miRNA相互作用的AGO蛋白在龙眼体胚发生过程中也具有重要的作用。本研究拟通过对AGO家族基因进行克隆,以及荧光定量PCR技术对龙眼体胚发生不同阶段以及四季密龙眼不同组织的中AGO基因的表达量进行分析,同时对其亚细胞定位进行研究,为揭示龙眼miRNA调控分子机制提供新的线索,并为调控龙眼等木本植物的胚胎发育提供理论依据。1龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因cDNA全长克隆通过对龙眼胚性愈伤组织的转录组分析和GeneBank中的比对,龙眼胚性愈伤组织中含有5种AGO蛋白,分别为AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO6,其中AG04基因的表达量极低。在此基础上,利用RT-PCR和RACE技术,对AGO1、AGO2、AGO5、AGO6进一步克隆,最终获得它们的cDNA全长序列：AGO1基因cDNA全长为3529 bp,开放阅读框为3183 bp,编码1061个氨基酸,命名为DlAGO1, GeneBank登录号为KM001869; AGO2基因全长为3128 bp,5端UTR长度为73 bp,3端UTR长度为121 bp,开放阅读框为2934bp(含终止子),编码976个氨基酸,命名为DlAG02,登录号为KM001870; AGO5基因的全长为3203 bp,开放阅读框为2919 bp,编码972个氨基酸,命名为DlAG05,登录号为KM001871；龙眼胚性愈伤组织AG06基因cDNA的全长序列3168 bp,开放阅读框(ORF)长为2700 bp,编码900个氨基酸,命名为DlAGO6,登录号为KF819529。2龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的生物信息学分析在上述基础上,利用生物信息学对龙眼胚性愈伤组织AGO基因家族的基因进行基本理化性质、磷酸化位点、蛋白质保守结构域等进行分析。对龙眼胚性愈伤组织中AGO1、AGO2、AGO5和AG06基因编码的氨基酸保守结构域分析结果显示,DLAGO2 PIWI区域含有DDD结构,DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6含有DDH结构,由此推测龙眼胚性愈伤组织的AGO1、AGO2、AGO5、AGO6蛋白可能具有切割mRNA功能,参与转录后水平基因沉默。磷酸化位点的预测结果显示,DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6蛋白丝氨酸磷酸化位点较多并N、C两端分布密集,中间部分分布均匀,AGO蛋白的PIWI结构域具有RNA内切酶活性,而该蛋白丰富的丝氨酸磷酸化位点,可能为增加该蛋白与小RNA结合后的转录后表达调控作用。DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6与拟南芥、水稻、葡萄AGO蛋白家族系统进化树分析,发现龙眼胚性愈伤组织的AGO蛋白可能分为四个分支,并且DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6分别属于龙眼胚性愈伤组织AGO蛋白的四个分支。3龙眼体胚发生过程以及龙眼不同组织器官中AGO1、AGO2、 AGO5和AGO6基因家族的表达定量分析用实时荧光定量技术对AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龙眼体胚发生过程中以及不同组织器官中进行相对定量表达分析。龙眼不同胚性阶段的表达情况：在龙眼体胚发生过程早期,随着体胚发生过程的推进,AGO1基因的表达量逐渐升高,在子叶时期的表达量有所降低,整体来看在非胚性阶段的时候表达量是最高的；AGO2基因在龙眼的不同胚性阶段的表达量具有差异,从整体趋势来说,相对表达量的趋势呈M型,在愈伤组织和球形胚时期的表达量是M型的两个顶点,在非胚性阶段、不完全紧实结构以及子叶胚时期表达量相对较低；AGO5基因在龙眼体胚的不同阶段的表达具有显著的差异,整体的呈现逐渐降低的趋势,随着体胚发生过程的推进,AGO5基因的表达逐渐降低,非胚性阶段的表达量高于其它胚性阶段；AGO6基因在龙眼体胚的不同阶段的表达具有显著的差异,整体的呈现逐渐降低的趋势,随着体胚发生过程的推进,AGO6基因的表达逐渐降低,但非胚性愈伤组织中的表达量相对低很多。龙眼不同组织部位的表达情况：AGO基因在龙眼不同组织部位中的表达具有差异显著,其中AGO1基因在叶、花蕾、小果、大果、果皮以及种子中的表达量相对较低,在果肉中的相对表达量最高,可能与果肉的形成有关,另外在成花和根中的相对表达量同样较高的,因此AGO1基因可能与花和根的发育相关miRNA具有相互作用关系；AGO2基因在根、叶、花蕾、成花、小果、大果、果肉、种子的表达量相对较低,在果皮内的含量很高,推测AGO2基因与果皮的发育有关的miRNA具有相互作用。AGO5基因果皮中的表达量显著高于其他组织部位,这个与AGO2基因相似,可能与AGO2基因有相互作用关系；AGO5基因在小果中的表达量极低,在大果中表达量也不高,却在果皮中表达量高,推测可能在果实成熟后期的果皮发育过程中具有重要作用；AGO6基因成花与果肉的表达最高,在叶、大果、果皮的表达量相对较低,在根和花蕾相对表达量较高,小果和种子的相对表达量高于叶等的组织部位。4龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的亚细胞定位分析本研究过程中构建了龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6蛋白的亚细胞定位载体,采用了农杆菌瞬时表达技术,于洋葱表皮细胞中观察AGO1、AGO2、AGO5和AGO6亚细胞定位荧光信号,结果显示,AGO1主要在细胞核和微体中,AGO2主要集中于细胞核和细胞质中,AGO5和AGO6主要集中于细胞核和细胞膜上。龙眼胚性愈伤组织AGO蛋白都定位于细胞核中,细胞核是生物体遗传物质以及核糖体合成的主要场所,对于细胞周期以及细胞衰老都具有重要功能,AGO蛋白的亚细胞定位的研究,有助于进一步探究基因功能。综上所述,通过龙眼胚性愈伤组织AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的序列和生物信息学分析,可以发现龙眼胚性愈伤组织AGO基因家族序列保守性较强,是一类保守的碱性蛋白,且龙眼AGO蛋白可以分为与水稻类似的四个分支。AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龙眼体胚发生过程中的差异表达,推测可能与细胞分裂速率有关,并在四季蜜不同组织中的差异表达,推测其可能参与特定器官的形态建成。亚细胞定位显示AGO1、AGO2、AGO5和AGO6均定位于细胞核中。细胞核是生物体遗传物质以及核糖体合成的主要场所,对于细胞周期以及细胞衰老都具有重要功能,AGO蛋白的克隆、生物信息学分析、表达分析及亚细胞定位的研究,有助于进一步探究该基因的功能。