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甘加型藏羊（Ovis arise）是典型的季节性发情动物。季节性发情动物接收不同光周期的刺激后经视神经将光刺激信号转变为神经冲动传递到松果体,刺激松果体分泌5-羟色胺和褪黑素（Mel）。AANAT与HIOMT是褪黑素合成过程中的关键酶,其活性与褪黑素的合成分泌紧密相关。已有研究表明,Kiss-1/GPR54系统在哺乳动物繁殖过程中具有重要的调控作用,Kisspeptin可调控下丘脑-垂体-卵巢轴器官功能活动,对哺乳动物初情期的启动、发情周期、排卵等生殖活动发挥着重要的调控作用。而“光周期-Mel-Kiss-1/GPR54-Gn RH”通路也已被证实是调控动物季节性繁殖的主要路径。下丘脑-垂体-甲状腺轴（hypothalamus-pituitary-thyroid axis,HPTA）作为典型的内分泌轴系也在调控动物的繁殖功能方面也发挥着重要的作用,有研究证明甲状腺功能减退发生在初情期之前,可表现为卵泡发育停滞,性器官萎缩等。为探讨褪黑素合成酶AANAT、HIOMT、Kiss-1/GPR54系统在甘加型藏羊视神经、松果体-下丘脑-垂体-甲状腺轴（Pineal-Hypothalamus-pituitary-thyroxine axis,PHPTA）的表达及其对繁殖活动的调控,本研究选取健康空怀且处于发情周期的甘加藏羊32只,分为发情期、发情前期、发情后期和间情期4组每组8只,并选取非繁殖季节（乏情期）8只为实验对照组。运用酶联免疫吸附法检测甘加型藏羊血浆Kisspeptin动态变化;应用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学染色方法分析视神经、松果体-下丘脑-垂体-甲状腺轴各组织中AANAT、HIOMT、Kiss-1、GPR54 m RNA和蛋白的表达及免疫阳性细胞的分布表达差异,分析其在发情周期的动态变化规律与藏羊发情之间的关系。结果如下:1、甘加型藏羊发情周期各时期血浆Kisspeptin分泌量呈动态变化,Kisspeptin平均含量从发情期开始升高,发情后期达到峰值后开始逐渐减少。发情周期各时期Kisspeptin平均分泌量均显著高于非繁殖季节乏情期（P＜0.05）,表明Kisspeptin调控藏羊的季节性发情和发情周期的功能活动。2、甘加型藏羊发情周期各时期和乏情期视神经和PHPT轴组织中均有Kiss-1、GPR54 m RNA及其蛋白的表达。（1）视神经Kiss-1、GPR54 m RNA的相对表达量在发情前期显著高于其他三个时期（P＜0.05）;松果体Kiss-1、GPR54 m RNA在乏情期达到最大值,但乏情期GPR54与发情后期间差异不显著（P＞0.05）;下丘脑和甲状腺均在发情后期达到峰值;垂体组织中二者的相对表达量在发情期显著高于其他时期（P＜0.05）。（2）WB结果显示:Kisspeptin蛋白含量在视神经发情后期显著高于其他时期;在乏情期松果体和下丘脑组织中含量最高;在垂体中间情期最高;在甲状腺组织中发情前期最高;GPR54蛋白含量在视神经、松果体、垂体和甲状腺组织发情前期最高,下丘脑组织间情期显著高于其他时期（P＜0.05）。3、甘加型藏羊发情周期各时期和乏情期视神经和PHPT轴组织中均有Kisspeptin、GPR54免疫阳性细胞分布,Kisspeptin与GPR54在视神经中主要分布在神经胶质细胞核和胞质中,发情后期可观察到细胞浓染;松果体细胞胞质中Kisspeptin与GPR54均呈强阳性表达;在下丘脑中Kisspeptin表达在神经元细胞和神经胶质细胞中,发情前期、发情期和发情后期可见细胞胞浆浓染,GPR54表达在神经元细胞胞质中,轴突中免疫阳性产物也清晰可见;垂体组织中,二者主要表达在嗜碱性细胞的胞质中,在发情前期可见Kisspeptin强阳性反应;在甲状腺中二者主要表达在滤泡细胞胞质中。各时期免疫阳性细胞着色有明显变化。4、甘加型藏羊发情周期各时期和乏情期松果体、下丘脑、垂体、甲状腺组织中均有褪黑素合成关键酶AANAT和HIOMT m RNA和蛋白的表达,且发情周期不同发情阶段其相对表达量有一定的差异,发情周期表达量显著高于乏情期（P＜0.05）:（1）AANAT m RNA的相对表达量在松果体和垂体中发情期最高,与其他各时期差异显著（P＜0.05）,下丘脑和甲状腺组织中在发情后期表达量最高,显著高于其他三个时期（P＜0.05）;WB结果显示:AANAT蛋白表达量在松果体和甲状腺组织发情前期最高,在下丘脑和垂体组织中间情期最高;（2）HIOMT m RNA相对表达量在松果体、下丘脑和甲状腺组织中在发情后期达到峰值,垂体中在发情期最高;WB结果显示:HIOMT蛋白表达量在松果体、垂体和甲状腺组织发情前期最高,下丘脑在间情期最高。5、免疫组织化学染色结果显示,甘加型藏羊PHPT轴组织中均存在AANAT和HIOMT免疫阳性产物的分布:（1）AANAT主要表达在松果体细胞胞浆和胞核,在发情后期可见细胞浓染,下丘脑神经细胞胞浆中呈强阳性表达,神经细胞轴突也可见清晰着色,在垂体嗜酸性细胞的胞浆以及甲状腺单层立方上皮细胞中也分布有AANAT免疫阳性产物;（2）HIOMT免疫阳性产物主要表达在松果体细胞的胞浆和胞核、下丘脑神经细胞胞浆和胞核、垂体嗜酸性细胞胞核和胞浆以及甲状腺滤泡旁细胞中。并且可以观察到不同发情阶段,免疫阳性细胞着色有明显变化。综上,甘加型藏羊发情周期血浆Kisspeptin分泌量呈动态变化,发情期升高,发情后期达到峰值,且发情周期各时期Kisspeptin平均分泌量均显著高于非繁殖季节乏情期,表明Kisspeptin调控藏羊的季节性发情和发情周期的功能活动。藏羊发情周期视神经、PHPT轴个各器官均有Kiss-1/GPR54 m RNA和AANAT、HIOMT m RNA及其蛋白的表达和免疫阳性细胞的分布,且不同时期各器官Kiss-1/GPR54、AANAT、HIOMT的表达和分布有差异性,表明Kiss-1/GPR54系统和AANAT、HIOMT对藏羊发情周期视神经和PHPT轴各器官活动有调控作用,且不同时期有差异。发情周期血浆Kisspeptin的动态变化及Kiss-1、GPR54在各组织中的差异表达会正向启动藏羊的发情行为;AANAT、HIOMT伴随发情周期的进行总体呈先升高后降低趋势,AANAT和HIOMT的高表达在甘加型藏羊繁殖准备阶段发挥重要作用。二者共同参与调节甘加型藏羊的生殖生理活动。