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研究背景和研究目的长期以来,急性胰腺炎的早期治疗策略一直以对症支持治疗为主,缺乏特异性的治疗手段。据文献报道,急性胰腺炎的总体死亡率约为2%,其中重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)的死亡率高达30%。胰腺炎相关腹水(pancreatitis associated ascitic fluids,PAAF)是胰腺炎患者常见的伴随症状。研究证实,PAAF中的促炎介质、消化酶、血红素以及游离脂肪酸等在促进急性胰腺炎病情恶化过程中起到了重要的作用。我中心前期的研究表明,通过腹腔穿刺引流(Abdominal paracentesis drainage,APD)排出PAAF,可以降低腹水和血液中促炎介质的浓度,有效控制SAP过程中的炎症反应程度,并能改善急性胰腺炎病情。然而APD改善急性胰腺炎病情的机制尚未完全阐明。急性胰腺炎是一种以全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)为特征的炎性疾病,炎症相关的免疫病理反应在急性胰腺炎病情进展中起到了重要的作用。酶原异常激活发生后,损伤的腺泡细胞迅速被固有免疫系统识别,启动炎症瀑布并进一步导致了SIRS。而巨噬细胞是固有免疫系统的重要成员之一,有研究表明巨噬细胞是SAP炎症风暴中炎症因子的主要来源。特别是腹腔巨噬细胞,PAAF的产生直接影响了腹腔巨噬细胞的微环境。业已证实,巨噬细胞能在不同微环境的刺激下启动不同的转录程序,分别激活形成具有促炎作用的经典极化(M1极化)和具有抑制炎症作用的旁路极化(M2极化),而PAAF能诱导腹腔巨噬细胞发生M1极化并产生大量促炎介质。巨噬细胞的极化状态具有高度的可塑性,近年来国内外学者针对诱导巨噬细胞改变极化表型在炎性疾病治疗中的作用进行了深入的研究,发现通过细胞因子干预、质粒转染、过继转移等方法影响巨噬细胞的微环境或直接改变其本身的基因表达,增加M2巨噬细胞的比例,能在胰腺炎、脓毒症、结肠炎、类风湿关节炎等多种疾病中发挥治疗作用。在既往研究中,我们发现APD能持续排出PAAF,降低腹腔内TNF-α、IL-1β及IL-6等促炎细胞因子的浓度,升高IL-4、IL-10等抑炎细胞因子的浓度,然而,APD改善腹腔炎症环境,降低全身炎症反应,特别是升高抑炎细胞因子浓度的机制尚不明确。基于现有研究,我们推测APD可能通过诱导腹腔巨噬细胞M2极化,从而发挥增加抑炎细胞因子浓度,降低全身炎症反应程度的作用。因此,本研究拟对SAP病程中腹腔巨噬细胞的极化状态以及APD对其极化状态的影响及机制进行探索,为更好地阐明APD在SAP治疗中发挥抗炎作用的机制提供实验依据。第一部分:腹腔穿刺引流术对重症急性胰腺炎大鼠腹腔巨噬细胞极化的影响目的:通过建立大鼠SAP及APD模型,观察APD对SAP大鼠腹腔巨噬细胞极化表型的影响。方法:将大鼠随机分为三组:假手术组(SHAM组)、SAP组和APD组,每组6只。采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射法建立SAP大鼠模型,在此基础上于大鼠右下腹植入腹腔引流管,建立APD模型,SHAM组开腹后翻动胰腺并关腹。术后12小时取材,H&E染色观察胰腺组织病理损伤程度并进行评分,ELISA法测定血清淀粉酶、脂肪酶、促炎因子和抗炎因子分泌情况,观察APD对胰腺炎严重程度、胰腺组织损伤及全身炎症反应程度的影响。流式细胞术检测腹腔巨噬细胞的表型极化,qPCR检测腹腔内总游离细胞iNOS、CD206基因的mRNA表达情况,观察APD对SAP大鼠腹腔巨噬细胞极化表型的影响。结果:与SAP组相比,APD组胰腺损伤明显减轻,病理评分显著降低。具体表现在:H&E染色可见,APD组大鼠胰腺组织的腺泡结构完整性好于SAP大鼠,腺泡水肿、坏死、红细胞渗出、炎细胞浸润等明显轻于SAP组大鼠。此外,APD组大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶浓度,促炎因子TNF-α和IL-1β水平较SAP组大鼠显著降低,同时抗炎因子IL-10、TGF-β浓度升高,上述结果说明APD组大鼠胰腺组织损伤及全身炎症反应程度较SAP组大鼠显著减轻。通过腹腔巨噬细胞表型分析可见,与SAP组大鼠相比,APD组大鼠腹腔M2巨噬细胞(CD68+CD163+细胞)显著增加,M2巨噬细胞相关蛋白CD206基因的mRNA表达显著上调,而M1巨噬细胞(CD68+CD86+细胞)及其相关蛋白iNOS基因的mRNA表达下调。同时,反映促炎/抗炎反应平衡的M1/M2比例也显著降低,说明APD组大鼠腹腔内的免疫平衡有向抗炎方向移动的趋势。第二部分:腹腔穿刺引流术诱导重症急性胰腺炎大鼠腹腔巨噬细胞M2极化的机制及价值目的:分析APD影响腹腔巨噬细胞表型极化的机制及其在SAP治疗中的作用。方法:动物分组及模型建立方法同第一部分。首先检测各组大鼠腹腔灌洗液中炎症因子浓度,分析炎症环境的差异。其次分离并培养原代腹腔巨噬细胞,再将各组大鼠的腹腔灌洗液按比例加入RPMI1640培养基,用于模拟不同的腹腔炎症环境,并用该环境干预原代培养的腹腔巨噬细胞。再用流式细胞术检测不同模拟环境下原代腹腔巨噬细胞的极化表型。随后对胰腺组织进行免疫荧光染色,分别以CD68+CD86+和CD68+CD163+为M1和M2巨噬细胞的表面标志,观察两类细胞在胰腺组织中的分布情况。最后用western blot法检测胰腺组织中Arg-1蛋白表达情况来分析M2巨噬细胞在胰腺组织中的作用方式。结果:APD显著降低了大鼠腹腔中促炎介质IL-1β和L-select的浓度并升高抑炎介质IL-4和IL-10的浓度。通过细胞实验发现,体外模拟APD腹腔炎症环境仍能增加原代腹腔巨噬细胞的M2极化,说明APD能通过改变腹腔炎症环境,影响腹腔巨噬细胞极化表型。免疫荧光染色结果显示,M1、M2两类巨噬细胞在胰腺组织中均有分布,在APD组大鼠胰腺中,M2巨噬细胞数量更多,且这一结果与通过western blot检测CD163和CD86表达量的结果一致。此外,我们还发现APD组大鼠胰腺组织中Arg-1蛋白的表达量明显高于SAP组大鼠,说明APD组大鼠胰腺组织中的M2巨噬细胞可能通过上调Arg-1的表达而发挥其免疫调节和促进组织修复的作用。全文结论通过APD将SAP大鼠腹腔内的PAAF引流至体外,可以降低腹腔中促炎介质的浓度,改善腹腔炎症环境,从而增加SAP大鼠腹腔巨噬细胞的M2极化。同时,M2巨噬细胞数量的上调还增加了腹水和血清中抗炎细胞因子浓度。此外,通过该操作,还增加了胰腺组织中M2巨噬细胞的分布,上调了Arg-1等有抑炎和组织修复作用的蛋白表达。最终,APD降低了SAP大鼠的全身炎症反应程度,促进了抗炎反应和胰腺损伤的修复,缓解了SAP病情。这些发现为深入理解APD治疗重症急性胰腺炎的机制提供了新的思路。