目的TIPE2 (tumor necrosis factor-a induced protein 8-like 2)是2002年新发现的一个基因,人TIPE2基因位于染色体1q21.2-lq21.3,由184个氨基酸构成,具有与死亡受体结构域(DED)相似的结构域和6个保守的a螺旋结构。TIPE2与TNFAIP8L1(TIPEl)和TNFAIP8L3 (TIPE3)同属于TNFAIP8家族。研究发现,TIPE2基因主要表达在胸腺,脾脏,淋巴结以及小肠粘膜等免疫器官和淋巴组织中。进一步研究发现,将小鼠TIPE2基因敲除后,会导致体重下降,多器官自发性炎症,脾肿大,血清学检测许多炎症因子如IL-1.IL-6, IL-12,TNF-a等的表达水平均升高。TIPE2基因敲除后小鼠炎症反应加剧,细胞实验发现TIPE2抑制NF-κB信号通路的活化,这些均证明它是一种新型的负性免疫调节蛋白,在固有免疫反应和适应性免疫反应中均发挥负性调节作用。但是,目前关于TIPE2的文献报道很少,而且主要是通过小鼠模型进行的机制研究,该基因在人类的些自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮病人(systemic lupus erythematosus, SLE)中的表达及其作用尚无研究。SLE是一种典型的自身免疫性疾病,其特征是产生多种自身抗体,造成全身多系统、多器官受累的慢性进行性炎症性自身免疫性疾病。虽然关于SLE疾病的研究报道很多,但是其确切发病机制尚不清楚。在SLE发病过程中,机体免疫系统紊乱,许多炎症性细胞因子如IL-4, IL-6, IL-12, IFN-γ(interferon-γ)等高表达,这些许多文献已经报道。有研究证明Ⅰ型干扰素(interferonl, IFN-I)系统在系统性红斑狼疮的发病机制中起着非常重要的作用。由于IFN-I包括山东大学硕士学位论文14个亚单位,这些亚单位有着共同的受体,所以通常用IFN-I诱导表达基因之一MX1(抗粘病毒1)的来代表IFN-I表达的总体水平。那么TIPE2作为新发现的固有免疫和适应性免疫应答的负性调控因子,其是否参与了SLE疾病的发病程,目前尚无报道。本研究的主要目的是通过检测SLE病人标本外周血单个核细胞(peripheral blood mononulear cells, PBMCs)中TIPE2 mRNA的表达水平以及该基因与MX1以及病人临床指标相关性分析,并且用人单核细胞系THP1做了些细胞实验,旨在初步探讨TIPE2是否参与了SLE的病程进展及其作用机制,为SLE的诊断与治疗提供新的依据。材料与方法1系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中TIPE2基因的检测1.1病例的选择与标本的收集于2008年10月至2009年3月间,从山东大学齐鲁医院收集刚入院的SLE病例资料,共计39例,全部符合1982年美国风湿病协会(ARA)修订的SLE的诊断标准,评估SLE的活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)为16.33±1.409。同时选取35例年龄和性别匹配的健康献血者。1.2外周血单个核细胞总RNA的抽提及cDNA的制备Trizol法抽提外周血单个核细胞总RNA,紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度,波长260/280 nm处的吸光度(A)值为1.8～2.0时用于实验,并统一定量为2.0μg。M-MLV反转录酶进行反转录制备cDNA。1.3半定量RT-PCR及实时荧光定量RT-PCR法检测TIPE2基因的表达根据PubMed中人TIPE2序列(GI:141802951),根据引物设计的原则,应用Premier Primer 5.0引物设计软件设计引物,为避免基因组DNA的污染,所设计引物均跨不同外显子。应用半定量RT-PCR及实时荧光定量RT-PCR检测SLE患者和健康对照者新鲜分离的PBMCs中TIPE2 mRNA的表达。2.系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞上TIPE2的表达与系统性红斑狼疮临床参数以及MX1的相关性分析利用Prism GraphPad软件对系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞上TIPE2的表达与系统性红斑狼疮临床参数SLEDA等水平以及MX1的相关性分析。3. TIPE2的表达和I型干扰素之间关系的分析3.1利用TIPE2的SiRNA干扰THP1细胞TIPE2 mRNA的表达以脂质体Lipofectamine2000为载体,用针对TIPE2特意靶点的SiRNA转染入人单核细胞系THP1后,用实时荧光定量RT-PCR的方法检测TIPE2, MX1,TNF-a mRNA的表达。3.2用不同浓度SLE病人的血清刺激THP1细胞分别用5%和25%浓度的SLE病人血清与THP1细胞共培养24h,同时用5%和25%浓度的健康人血清做对照,用实时荧光定量RT-PCR的方法检测血清刺激24h后THP1细胞中TIPE2和MX1 mRNA的表达水平。3.3用IFN-α2a和IFN-α2b刺激THP1细胞在24孔板中,将THP1细胞以1×106/ml铺板,用均为终浓度1000U/ml的IFN-a2a和IFN-a2b刺激细胞,用PBS组作为对照,分别于8h,24h收集细胞,用实时荧光定量RT-PCR的方法检测TIPE2和MX1 mRNA的表达。4地塞米松对TIPE2表达的影响在24孔板中,将THP1细胞和分离的正常人外周血PBMC分别以1×106/ml铺板,加入终浓度为1×10-6mol／L的地塞米松(dexamethason, Dex),并同时用PBS组作对照,分别刺激2h,12h,24h后,用实时荧光定量RT-PCR的方法检测TIPE2 mRNA的表达。结果1 SLE患者PBMCs中TIPE2和MX1 mRNA的表达及与SLE患者活动指数的相关性分析采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测SLE患者和健康对照者PBMC中TIPE2和MX1的mRNA的表达,以2(?)表示TIPE2和MX1的表达。结果显示SLE患者和健康对照者TIPE2的表达值分别为4.207±0.5772和8.620±1.128,SLE患者TIPE2 mRNA的表达水平显著降低(p=0.0004)；SLE患者和健康对照者MX1的表达值分别为44.480±5.400和23.081±4.866, SLE患者MX1 mRNA的表达水平显著升高(p=0.0.0031), MX1在SLE患者表达水平升高与文献报道相符。相关性分析表明,SLE患者的活动指数SLEDAI与TIPE2 mRNA的表达呈负性相关,相关系数r=-0.5016, p=0.0011; SLE患者的活动指数SLEDAI与MX1 mRNA的表达呈正相关,相关系数r=0.4814, p=0.0019。分析TIPE2和MX1的相关性,两者为负性相关(r=-0.8083, P<0.0001)。2利用TIPE2的SiRNA干扰THP1细胞TIPE2 mRNA的表达后,MIX1和TNF-a mRNA的表达情况利用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测针对TIPE2基因特异靶点的SiRNA对THP1细胞表达TIPE2 mRNA的干扰效果,结果表明干扰效率平均达到56.62%；干扰TIPE2 mRNA的表达后,MX1的表达降低,三次结果中,TIPE2干扰率高的与干扰率低的相比,MX1的表达相对增高；TNF-a的表达升高。3与血清共培养后THP1细胞TIPE2和MX1 mRNA的表达5%和25%血清刺激24h后,SLE患者血清组与正常对照组相比TIPE2的表达均有所降低,但是统计学差异不明显；MX1的表达均升高,且有统计学意义。4药物刺激用地塞米松刺激THP1细胞和分离的正常人PBMCs,2h,12h,24h时分别与对照组相比TIPE2的表达均有有升高趋势,且24h时显著升高；用IFN-a2a和IFN-a2b刺激THP1细胞,与对照组相比,MX1的表达升高且有统计学意义,TIPE2的表达无显著变化。结论1 SLE患者PBMC中TIPE2 mRNA的表达水平与正常对照组相比显著降低,并且与SLEDAI呈负性相关关系；与已经非常明确的并且在SLE发病过程中至关重要的IFN-I诱导的基因MX1的表达负性相关。2当细胞系THP1中TIPE2表达降低时,MX1的表达降低,TNF-a的表达升高,这提示TIPE2作为TNF-a诱导的表达基因,它表达水平的降低可能反馈性地使TNF-a表达升高。3地塞米松作为治疗SLE疾病的一种药物,参与控制SLE发病过程中对炎症因子分泌的调控,降低机体的炎症反应,TIPE2作为免疫系统的负性调控因子,在地塞米松刺激下表达水平升高,参与控制机体的炎症反应。综合结果提示,TIPE2作为一种新发现的免疫负性调节因子,它的低表达有可能不能够有效地对机体进行负性调控,使许多炎症因子的表达升高,参与SLE病人的发病进程。创新性和意义TIPE2是新发现的基因,与疾病的关系尚不清楚,关于TIPE2与人类疾病的研究更少。本研究首先发现TIPE2在自身免疫性疾病SLE的PBMCs中,表达水平降低,且其降低的水平与疾病的严重程度密切相关。SLE发病机制尚不明确,关于其的治疗也有诸多限制。TIPE2作为新发现的免疫负性调控因子,可能为治疗SLE疾病提供新的靶点。目的：锌脂蛋白A20(zinc finger protein A20)是近年来在细胞内源性保护机制的研究中发现的一类新的蛋白质。A20是体内NF-κB信号系统重要的负反馈调节因子,也是防止体内炎症反应失控的重要免疫负反馈调节蛋白。系统性红斑狼疮是一种典型的自身免疫性疾病,其特征是产生大量的自身抗体和多系统受累,该疾病存在着广泛的炎症反应,许多炎症因子表达水平升高。已有研究证实系统性红斑狼疮病人体内存在着NF-κB信号通路的激活。本研究的目的是调查系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞锌脂蛋白A20的表达水平及其与该疾病临床指标的相关性,初步探讨锌脂蛋白A20在系统性红斑狼疮患者发病机制中的作用。方法：采用实时荧光定量RT-PCR的技术检测37例系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞锌脂蛋白A20的表达,同时与同期32例健康者外周血单个核细胞锌脂蛋白A20的表达做对照进行比较。结果：系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞锌脂蛋白A20的表达水平较健康对照组明显降低(p=0.0133),而且活动期病人与静止期病人相比A20的表达显著降低(p=0.0006),狼疮肾炎患者与非狼疮肾炎患者相比表达也显著降低(p=0.0188)；系统性红斑狼疮患者锌脂蛋白A20的表达水平与系统性红斑狼疮患者的活动指数、血沉呈现负相关关系(r=-0.4661, p=0.0036; r=-0.5222,p=0.0009)。结论：锌脂蛋白A20可能参与了炎症损伤的自我保护过程,其机制可能是通过抑制核转录因子NF-κB,进而下调促炎细胞因子的表达。锌脂蛋白A20在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞表达水平降低,不能够有效抑制炎症因子的表达,炎症因子的高水平表达促使狼疮病人疾病程度的加重。对锌脂蛋白A20在系统性红斑狼疮病人外周血单个核细胞中表达的研究,为进一步明确系统性红斑狼疮的发病机制奠定基础。