组织蛋白酶K(Cathepsin K)与组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)是骨代谢过程中两种关键的水解酶：(1) Cathepsin K作为哺乳动物胶原蛋白酶，能够催化水解I-型胶原蛋白中三重螺旋结构。Cathepsin K的过量表达，可引发过度骨吸收效应，从而直接导致骨质疏松症的产生。因此，Cathepsin K被视为治疗骨质疏松症的关键靶标酶。(2) TNAP是一种磷脂酰肌醇锚定蛋白，在成骨细胞以及基质囊泡中具有较高的酶活性，作为骨骼矿化的生物标识物，TNAP能够水解肌体中磷酸盐底物，为骨骼的矿化提供无机磷。而TNAP的过量表达，可导致骨关节炎的产生。因此，TNAP是治疗骨关节炎的靶标酶。论文作者所在课题组多年来一直从事组织蛋白酶K有机小分子抑制剂的设计合成、优化及相关机理研究。基于对CathepsinK催化中心重要活性位点的研究，本课题组已设计并合成出一系列高选择性、强抑制效应的拟肽腈类组织蛋白酶K抑制剂(CKI)，并对该系列化合物的体外抑制活性及选择性进行测定。然而，相对于细胞水平而言，CKI的调控机理与抑制效应，目前仍然是未知的。本论文选择了拟肽腈类组织蛋白酶K抑制剂中，具有体外最高抑制效应及最好选择性的小分子化合物CKI-13，结合其同分异构体CKI-8及商业化组织蛋白酶家族抑制剂E-64，在细胞水平上，对比研究了三种抑制剂对骨吸收过程的影响，为寻找有效治疗骨质疏松症的药物，建立了一系列可靠的细胞学模型和临床前检测方法；另外，我们通过运用红外光谱技术，建立了在生理条件下检测基质囊泡内、尤其是活细胞内TNAP酶活力的新方法，为高量、快速筛选TNAP酶抑制剂，提供了可靠的理论依据。本论文主要研究内容和创新点包括以下三个部分：(1)组织蛋白酶K抑制剂对细胞内骨矿化及骨吸收的影响：以人成骨肉瘤细胞(Human osteosarcoma Saos-2cells)、小鼠颅骨成骨细胞(Calvaria primaryosteoblasts)、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)及小鼠骨髓破骨细胞(Primary osteoclasts)四种细胞为研究模型，检测组织蛋白酶K抑制剂CKI-8、CKI-13及商业化的组织蛋白酶抑制剂E-64对细胞存活率（MTT细胞毒性实验）、骨矿化以及骨吸收效应的影响。实验结果表明：CKI-8与CKI-13能够有效抑制细胞内组织蛋白酶的活性，并且在一系列细胞测试中，显示出低细胞毒性的特点；虽然Saos-2细胞模型中，CKI-13对于矿化过程具有一定的抑制，但是，其在低浓度下对骨吸收过程的抑制效应，还是很好的展现出来；CKI-8与CKI-13能够有效抑制细胞水平上的骨吸收过程，并且对细胞在骨表面的迁移，也有一定抑制作用。(2)基质囊泡水解焦磷酸盐的红外光谱检测：基质囊泡(MVs)作为骨骼矿化的引发场所，富含矿化生物标记物——TNAP；作为矿化的抑制剂，焦磷酸盐也是TNAP的生理底物。我们以孵育17天的小鸡胚胎骺软骨中，提取基质囊泡，并作为实验检测模型，利用红外光谱技术，在近生理条件下(Tris-HCl buffer, pH=8.0)，考察基质囊泡水解其生理底物焦磷酸盐(PPi)的反应过程。实验结果表明：在近生理条件下，能够被MVs水解，其1107cm-1处红外特征吸收峰强度随反应的进行逐渐降低；无机磷酸作为水解产物，在1080及990cm-1处，随PPi吸收峰的下降而逐渐上升。实验结果反映了利用红外光谱技术，以PPi作为底物，检测MVs中TNAP酶活力的可行性。(3)活细胞内生物酶活力的红外光谱测试：人成骨肉瘤细胞(Humanosteosarcoma Saos-2cells)的细胞膜质膜顶端微绒毛可释放MVs，该细胞经过刺激诱导后，同样富含TNAP。因此，我们以Saos-2细胞作为研究模型，利用红外光谱技术，在不同的TNAP生理底物下，对细胞原位碱性磷酸酶的酶活力进行了红外光谱检测；同时，以细胞内蛋白质酰胺II带红外吸收峰作为内标，对细胞内总蛋白浓度进行计算，从而直接获得TNAP酶活力的比活值(Specific activity)；利用该检测方法，我们对左旋咪唑(Levamisol, TNAP酶抑制剂)的IC50值进行了评估与计算。