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类鼻疽病(melioidosis)是由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)所致的地方性传染病,主要流行于东南亚和澳大利亚北部等热带和亚热带地区。人通过接触含有致病菌的水和土壤,经破损的皮肤而受感染。泰国伯克霍尔德菌(Burkholderiathailandensis)是和高致病的类鼻疽伯克霍尔德菌和鼻疽伯克霍尔德菌(马鼻疽病原菌)接近的一种对人和动物无致病性革兰氏阴性细菌。由于和类鼻疽伯克霍尔德菌具有相似的免疫反应,同时不存在生物安全问题,无需在生物安全三级实验室进行操作,泰国伯克霍尔德菌在实验研究中通常用来替代类鼻疽伯克霍尔德菌而进行相关的研究工作。
类鼻疽伯克霍尔德菌具有高运动性和高致病性,临床感染常伴随着生物膜的形成,增加了抗生素治疗的难度,所以开发新的抗生素类药物显得尤为重要。5’-甲硫腺苷核苷酶/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(5-methylthioadenosine nueleosidase/S-S-adenosylhomocysteine nueleosidase,MTAN)是一个双功能酶,分别催化5’-甲硫腺苷(5’-methylthioadenosine,MTA)和S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)水解产生5’-甲硫基核糖(5-methylthioribose,MTR)或S-核糖高半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine,SRH)和腺嘌呤(Adenine,Ade)。MTAN在细菌的代谢,包括在诸如甲硫氨酸、硫一腺苷一甲硫氨酸、蛋白质与DNA的甲基化作用,以及乙烯、聚胺的生物合成,甲硫氨酸的循环补救途径中发挥了重要功能,同时MTAN在细菌群体感应方面起着重要作用,通过抑制MTAN的活性可以直接阻断信号分子2(autoinducer2,AI-2)的合成,并且反馈抑制信号分子1(autoinducer1,AI-1)的合成,而从下调细菌的群体感应,降低细菌的毒力,生物膜和耐药性。MTAN在病原细菌中广泛存在,而哺乳动物中不存在,可以通过人工合成MTAN底物类似物抑制其活性,是一个理想的抗生素类药物靶标。
本研究首先通过同源重组的方法构建了敲除mtan的泰国伯克霍尔德菌突变体E264△mtan。群体感应相关的表型比较发现,突变体菌株的泳动和生物膜的形成和代谢产物的抑菌活力下降,而在在蛋白酶水解,溶血性等未发生明显的改变。在LB培养基中,两者的生长曲线基本相同,生长曲线同步的AI-1(AHLs)检测发现,E264△mtan菌株产生AI-1的能力和E264相比明显降低。根据基因组测序结果,构建了单拷贝融合ιacZ比较BtaI-BtaR系统中启动子活力,BtaI2和BtaI1启动子活性出现显著下降,而BtaR1,BtaR2,BtaR3,BtaR4,BtaR5受体启动子活性有显著提高。
我们克隆了E264的mtan基因异源表达并通过镍柱亲和纯化。泰国伯克霍尔德菌MTAN酶促动力学显示其底物MTA的催化效率是是9.5×104 mol-1·L·s-1,催化活性和已经报道不同来源的MTAN活性相当,但同样条件下未能检测到其对底物SAH的水解。AI-2相关的甲硫氨酸代谢通路证明LuxS的缺失是泰国伯克霍尔德菌不能合成AI-2的原因,但是MTAN具有水解SAH的能力。最终增加蛋白质浓度重新测定发现MTAN催化SAH的催化效率3.6 mol-1·L·s-1,催化效率相比底物MTA的催化效率低26000倍,具有明显的底物偏爱性。MTAN在伯克霍尔德菌中高度保守,但是不同来源的MTAN序列同源性较低。MTAN的系统进化树可以将细菌分为LuxS+和LuxS-两种,推测在LuxS-细菌的。MTAN均具有不同程度的底物偏爱性。SAH在体内是甲基转移酶的潜在抑制剂,SAH的代谢过程对于体内甲基化水平具有重要作用。在真核生物和LuxS-细菌中,S-腺苷高半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)可逆的水解SAH产生高半胱氨酸(homocysteine,Hcy)和腺苷(adenosine,Ado)。AdoHcyase的系统进化树可以将细菌和真核生物分开。我们同样异源表达了AdoHcyase,并且完成了相关酶动力学测定。
我们通过His pull-down和质谱鉴定得到了MetK和GroEL1458两种蛋白质可以体外同MTAN结合。Far Western Blotting验证了MTAN可以同MetK,GroEL1458,GroEL0916,GroEL1938体外结合。LacZ启动子测定发现E264△mtan中GroEL和MetK的启动子活性均出现下降,E264A中仅有GroEL1458发生了下降,热稳定性实验证明E264△mtan和264A菌株热稳定性明显降低(p<0.05)。Western blotting方法证明两种蛋白质的表达量在突变体中下降。泰国伯克霍尔德菌的热稳定性和群体感应活动相关,可能还调节了耐热多糖等参与其对热稳定的影响。体外添加AI-2分析AI-2对泰国伯克霍尔德菌生物膜和热稳定性等群体感应的影响,结果未发现AI-2对泰国伯克霍尔德菌有明显的调控作用。