本课题在分析关键生育期、不同棉花品种的不同组织之间内生细菌的数量动态和分离鉴定拮抗黄、枯病菌的基础上,逐步筛选出对落叶型黄萎病有显著生防作用的内生细菌菌株,对生防内生细菌菌株进行定殖潜力研究以期探讨生防菌株的生防机理,并对生防内生细菌进行种属鉴定。从而为利用内生细菌防治棉花黄萎病提供了载体、奠定了理论基础。本研究主要内容如下：1棉花内生细菌数量时空动态及其对棉花黄、枯萎病菌的拮抗性1.1棉花内生菌的数量动态为了解棉花内生细菌数量动态,对棉花根、茎、叶表面灭菌,采用稀释平板法分离棉花内生细菌。棉花内生细菌数量动态显示：棉花根中内生细菌的数量显著高于茎、叶；根的苗期总体内生细菌数量低于开花期、吐絮期,茎、叶中的内生细菌数量在不同生育期呈现一定的波动性,但趋势性不明显；6个棉花品种根中内生细菌平均数量差异并不显著,但茎、叶中内生细菌数量不同品种间呈现一定程度差异。棉花内生细菌数量动态结果表明：不同棉花的品种,生育期与器官影响棉花内生细菌的数量。1.2内生细菌的体外拮抗黄、枯萎病菌的鉴定为从棉花中获得拮抗黄、枯萎病菌的内生细菌资源,用对峙培养法鉴定棉花内生细菌对棉花黄、枯萎病菌的拮抗作用。在分离的1306株棉花内生细菌中,显著拮抗强致病落叶型黄萎病菌株V107、中等致病非落叶型黄萎病菌株V396、棉花枯萎病菌菌株F108分别为82,226,217个,同时拮抗拮抗黄、枯萎病菌的内生细菌(DAEB)菌株有44个。根中拮抗V107、V396、F108菌株比例为12.66%、34.45%、31.66%；茎中拮抗V107、V396、F108菌株比例为1.20%、6.95%、7.67%；叶中拮抗V107、V396、F108菌株比例为2.56%、3.41%、4.26%。内生细菌的体外拮抗黄、枯萎病菌的鉴定表明：根中拮抗内生细菌数量远高于茎和叶,拮抗V107的内生细菌数量显著低于V396,F108。2.拮抗内生细菌鉴定2.1根中DAEB分子鉴定为大致了解根中DAEB的种类特性,我们对根中DAEB进行16S rDNA序列测定及BOX指纹图谱分析。序列相似性分析表明：39个DAEB菌株属于细菌域变形杆菌门和拟杆菌门中的7个属。变形杆菌门占据绝对优势地位,包括了38个菌株,拟杆菌门1株。优势种群为肠杆菌属、泛菌属分别有17,14个菌株,另鸥文氏菌属4株；埃希氏菌属、根瘤菌属、克雷伯氏菌属及稳杆菌属各1个菌株。这其中有9个菌株与已报道的可培养菌株的序列相似性低于97%,这些菌株可能是新的属或种。通过BOX指纹图谱数据可将这39个DAEB聚类成35个簇。DAEB分子鉴定表明：棉花根部拮抗内生细菌不仅具多样的属种类,而且具丰富的基因型。2.2 HA02分类地位的确定为明确HA02的属种类,用培养特征、形态特征、生理生化测试、和16S rDNA序列比对,及基于16S rDNA序列同源性而构建的HA02系统进化树对HA02进行鉴定。HA02形态、生理生化测试特征显示：该菌株与肠杆菌属Enterobacter sp.相似。在EzTaxon server 2.1数据库中HA02的16SrDNA序列与生癌肠杆菌Enterobacter cancerogenus LMG 2693(z96078)同源性最高,基因相似性为99.9%；系统进化树中,HA02与Enterobacter cancerogenus, Enterobacter asburiae处于一分支内,结合形态学、生理生化特征,将该HA02菌株鉴定为Enterobacter sp.。3.DAEB拮抗机理与安全性测定为探讨根中DAEB拮抗机理,用琼脂扩散法检测其胞外几丁质酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶活性及产铁载体、产生长素能力。39个DAEB菌株中,18个具有蛋白酶活性；15个具有几丁质酶活性；然而,仅各有一株DAEB菌株具纤维素酶与果胶质酶活性；没有检测到DAEB具有木聚糖活性。有10个DAEB个菌株分泌生长素。所有DAEB菌株产铁载体。拮抗机理测定表明：拮抗内生细菌拮抗性机理具有很大的复杂性,产铁载体可能起到关键作用。为评估DAEB菌株的安全性,进行了种子发芽试验。棉花种子以108cfu ml-1菌悬液处理后11天后,有9个DAEB菌株或是提高了发芽率,或是增加下胚轴+根的长度,从而显著提高种子活力指数。相反的,也有7个DAEB菌株显著抑制种子活力。安全性测定表明：部分拮抗菌株具有生长促生潜力,拮抗内生细菌可能产生植物生长调节剂来影响植物的生长。4.拮抗内生菌对棉花黄萎病防治作用4.1 DAEB温室诱抗和盆栽控病试验测定为初筛对V107的有生防作用的DAEB菌株,通过挑战接种进行温室试验、模拟自然条件进行盆栽试验。挑战接种试验中,39个根中DAEB菌株,生防V107效果大于50%有12株。盆栽控病试验中,选取的10个DAEB菌株作为供试菌株,其中菌株HA02、CK06、HA03防治棉花黄萎病的效果达到了50%以上。温室试验与盆栽试验表明：筛选的部分拮抗内生菌具有较好的抗黄萎病的生防潜力。4.2拮抗内生菌HA02, CK06处理田间试验效果为了解具生防潜力的拮抗内生菌对V107在田间试验中的生防效果,对供试拮抗内生菌HA02, CK06设置了灌根、灌根加注射两种接种处理方法。田间试验显示：HA02的灌根、灌根加注射两种处理方法的叶面病情指数分别为33.3和31.8,显著低于对照(61.5),两种处理叶面生防效果分别为45.8%、48.3%；剖杆病情指数为66.7、68.0,亦显著低于对照(79.7),HA02两种处理剖杆生防效果16.3%、14.8%。CK06同样两种处理叶面病情指数与剖杆病情指数与对照相当,几乎无防效。HA02两种处理显著增加了棉花的株高、果枝台数、单株结铃数、单铃重；而棉花接种内生菌CK06后,对棉花产量相关性状无显著影响。田间试验还显示：灌根、灌根加注射两种接种内生菌处理方法所引起的生防效果、产量相关性状之间的差异并不显著。5.生防内生菌HA02的定殖研究5.1生防内生细菌HA02的在棉花体内定殖为探讨生防内生菌HA02的生防机理,用CaCl2法制备获得含荧光标记(gfp)标记和绿霉素抗性稳定的转化子HA02-gfp,用HA02-gfp跟踪其在植株体内的定性与定量定殖。本试验获得标记菌株UA02-gfp的生长代时与亲本HA02相差不大,并保持了亲本菌株拮抗黄病菌的特性、防病效果,因而我们用HA02-gfp模拟HA02在棉花植株体内的定殖。HA02-gfp浸棉种处理后的出苗1-40天,HA02-gfp在根的内生细菌数量波动范围log10 2.74～5.26 cuf/gfw之间,从出苗1d到10d内,根中的内生细菌菌量都有明显的增加的过程,其后呈下降趋势,到30天菌量有所上升,40天仍可检测到内生细菌数量达Iog10 2.74cuf/gfw。茎的内生细菌数量远低于根,波动范围在log10 0～3.73 cuf/g-fw,变化趋势与根基本一致,但到40天检测不到HA02-gfp数量存在。HA02-gfp主要存在于棉花根部,所以HA02-gfp定性定殖研究我们以棉花根作为对象。HA02-gfp接种棉种7天后,立体荧光显微镜观察到,HA02-gfp主要定殖在棉主根的成熟区,侧根,侧根与主根交接处。共聚焦激光扫描显微镜观察成熟区切片显示：HA02-gfp接种棉种7天后,HA02-gfp主要以定殖在近外皮层、被厚壁的皮层细胞包围的胞腔内、表皮,也偶见于胞间隙处定殖。HA02-gfp接种12、17天后,HA02-gfp定殖在近外皮层、被厚壁的皮层细胞包围的胞腔内为主,几乎不见在表皮的定殖。5.2 HA02-gfp在其它宿主植物内的定殖数量动态为研究HA02的其它宿主范围及其定殖数量动态,用平板稀释法研究HA02-gfp在水稻、小麦、玉米、大豆和油菜根与茎内的定殖数量。HA02-gfp浸泡水稻、小麦、玉米、大豆和油菜种子,出苗1-30d天,除在水稻的根、茎中,我们一直检测不到HA02-gfp外,在其它植物品种的根、茎内均可检测到HA02-gfp的存在。其中玉米根茎、内的HA02-gfp最为丰富,小麦、玉米和油菜出苗5-10天根、茎的HA02-gfp数量都呈下降趋势。HA02-gfp在小麦、玉米和油菜根内数量较茎高,但大豆茎中的HA02-gfp数量反而比根中高。HA02-gfp在其它宿主植物内的定殖数量动态表明：HA02-gfp定殖的寄主范围具有广谱性,HA02-gfp在其它植物品种定殖数量存在较大宿主种类、时间、组织差异。内生细菌是与寄主植物在长期共同进化过程中形成的,内生细菌在植株体内具有稳定的生存空间,不易受外界环境的影响,在植物体内定殖,不会有环境污染问题,它的合理应用将减少化学药剂造成的环境污染,提高农田生态系统的生物多样性,有利于保持生态平衡。研究内生细菌的病害生物防治理论与应用,不仅会在植物病害防治中发挥重要的作用,而且为为实现农业的可持续发展战略提供新的思路。