本课题以392头荷斯坦公牛为样本，通过直接测序、PCR-RFLP和CRS-RFLP等方法对公牛TNP2基因和CD9基因中的单核苷酸多态性(SNPs)位点进行扫描，将这些SNPs位点与公牛的精液品质进行关联分析，筛选与公牛精液品质相关的分子标记，并初步探究这些SNPs影响精液品质的遗传机理，为下一步培育高产优质种公牛提供参考依据。一．TNP2基因多态性与公牛精液品质的关联性分析精子发生过程中，单倍体精细胞在形态和生理上经历了一系列复杂的变化。染色质重组是其中非常重要的过程，它是由过渡蛋白和鱼精蛋白取代组蛋白来介导的。Prm1、Prm2和TNP2三个基因编码基本的染色体蛋白，它们位于同一个基因簇，协同调控精子发生过程。牛的TNP2基因长1560bp，只有一个内含子，在精子中大量表达，表达过程受转录后基因调控，该基因最初在圆形精子中转录，之后保持约6d失活状态，最终在长形精子细胞中翻译为TNP2蛋白。本实验在公牛TNP2基因中发现了3个SNPs，分别为g.269G>A，g.480C>T和g.1536C>T。g.269G>A位于外显子1上，该突变为错义突变，突变后第62个氨基酸Arg变为His，该位点GG和AA基因型个体鲜精活力显著高于GA基因型个体，畸形率显著低于GA基因型；g.480C>T位于内含子上，毗邻外显子，经预测该突变可能导致TNP2蛋白空间构型变化，该位点TT基因型个体畸形率显著低于CC和CT基因型；g.1536C>T位点位于3’UTR区域，预测能够与miRNA结合，调控基因表达，该位点CC是优良基因型，其采精量和冻后活力都显著高于CT和TT个体。利用SHEsis和PHASE在线软件对3个SNPs位点进行单倍型构建，共构建出8种单倍型，发现18种单倍型组合，通过SAS软件对不同单倍型组合个体的精液品质进行关联分析，结果显示，H1H4和H8H4是精液品质较高的单倍型组合，其个体的鲜精密度、鲜精活力显著高于其他个体，且畸形率较低。二．Bta-miR-154与牛TNP2基因3’UTR相互作用miRNAs是一类小分子非编码RNA，长约18~24nt，它主要通过与靶基因mRNA3’UTR特异性序列结合，引起mRNA降解或翻译抑制，从而在转录后水平调节靶基因的蛋白质合成。通过软件预测发现Bta-miR-154可能与突变后的TNP2基因3’UTR结合，且g.1536C>T位于结合种子区。通过细胞内实验来验证这一预测，将bta-miR-154质粒，TNP23’UTR荧光素酶表达质粒以及β-gal质粒共转MLTC-1细胞，结果表明，与miRNA control质粒相比，bta-miR-154质粒与pMIR-REPORT Luciferase-TNP2突变后的重组质粒共转染可使细胞的荧光素酶活性下降，并且有剂量依赖性。通过Q-PCR检测g.1536C>T位点不同基因型个体中TNP2mRNA的含量，结果发现，TT基因型个体中TNP2mRNA的含量显著低于CC和CT基因型（P＜0.05），同样说明miRNA的结合导致TNP2mRNA含量下降，与细胞内荧光素酶结果一致。三．CD9基因启动子活性分析CD9是四次跨膜蛋白超家族的成员之一，它是介导精卵质膜融合的一种重要的蛋白分子，牛的CD9基因5’端启动子区域缺失TATA box，但含有GC富集区，－302到－183区域GC含量高达88％，其间一些序列可与各种转录因子结合，包括sPl、AP2、GATA、NF-ΚB等，这些位点的存在可能涉及基因的转录调控机制。为探讨CD9基因的表达调控机制，本实验首先对CD9基因的5’区域进行了克隆并筛选SNPs位点，然后根据生物信息学分析构建了不同长度的缺失片段表达载体，转染293T和MLTC-1细胞，并通过双荧光素酶报告系统对各个片段的启动子活性进行了检测。结果发现，CD9基因5’调控区存在两个SNPs位点，分别为g.-298C＞G和g.-943C＞A。其核心启动子位于-609—+50bp处，-1640—-1125bp之间存在负调控元件。启动子活性不具有严格的细胞特异性，但在MLTC-1细胞中的启动子活性显著高于293T细胞。g.-943C＞A位点突变导致启动子活性下降，原因可能是由于影响了启动子与转录因子SP1的结合。