钙周期素结合蛋白（calcylin binding protein，CacyBP）是Filipek等首先从艾氏腹水瘤细胞中发现的一种约30kDa的蛋白质，其可以和钙周期素（calcyclin或S100A6）结合，故此得名；之后在研究P53诱导的β-catenin泛素化降解新通路时，发现一种可以与sina的同源基因Siah-1（seven in absentia homolog1）结合的蛋白，被命名为SIP（Siah-1interacting protein），经序列分析，SIP和鼠CacyBP93%相同，因此，认为SIP即为人CacyBP。目前就把钙周期素结合蛋白命名为CacyBP/SIP。CacyBP/SIP是S100家族的靶蛋白之一，可以和S100A1、S100A6、S100A12、S100B及S100P结合。同时，S100蛋白又是以EF-手形（EF-hand）结构为特点的钙结合蛋白家族成员之一，当其和Ca²⁺结合后，构象发生改变，结合相应的靶蛋白，发挥自身特异的生物学效应。此外，研究显示，神经元细胞未受刺激时，Ca²⁺浓度为50nM，CacyBP/SIP位于细胞质中；用KCI处理细胞后使Ca²⁺浓度升至300nM，CacyBP/SIP环状定位于核周，即神经元细胞中Ca²⁺浓度的变化可以诱导CacyBP/SIP的核转位，那么Ca²⁺是否通过与S100结合，激活S100活性，并通过S100与CacyBP/SIP结合，使CacyBP/SIP作为第三信使进入细胞核传递信号，本课题将对此进行探讨。目的1.结肠癌SW480细胞中Ca²⁺浓度变化对CacyBP/SIP核转位的影响。2.结肠癌SW480细胞中，核转位前后S100A1、S100A6与CacyBP/SIP的结合情况及结合量的变化情况；抑制相应S100蛋白表达，观察其对CacyBP/SIP核转位的影响。方法1.给予不同浓度Ca²⁺载体ionomycin（0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）刺激结肠癌SW480细胞，通过间接免疫荧光，激光共聚焦观察CacyBP/SIP在细胞内的定位变化，并动态扫描细胞内荧光强度的变化，记录细胞内游离Ca²⁺浓度的相对水平。2.给予Ca²⁺载体ionomycin（5μmol/L）和不同浓度Ca²⁺拮抗剂BAPTA/AM（0μM、5μM、10μM、25μM）共同刺激结肠癌SW480细胞，通过间接免疫荧光，激光共聚焦观察Ca²⁺浓度降低后CacyBP/SIP在细胞内的定位变化，并动态扫描细胞内荧光强度的变化，记录细胞内游离Ca²⁺浓度的相对水平。3.采用MTT法检测细胞的活力及用Annexin V/PI法检测细胞凋亡的情况，排除由于细胞内Ca²⁺超载对本实验的影响。4.升高Ca²⁺浓度，采用免疫共沉淀法检测核转位前后S100A1、S100A6与CacyBP/SIP的结合情况及结合量的变化情况。5.设计针对S100A6的三组siRNA，通过Real-TimePCR和Western blot方法筛选出一组沉默效果最好的siRNA，转染结肠癌SW480细胞，免疫荧光检测抑制S100A6表达对CacyBP/SIP核转位的影响。结果1.CacyBP/SIP主要位于细胞质中（未给刺激时），在给予ionomycin刺激后CacyBP/SIP发生核转位，并于5μmol/L刺激时核转位现象最为明显（CacyBP/SIP主要位于细胞核中），随ionomycin浓度（10μmol/L）进一步升高， CacyBP/SIP又重新分布于细胞质和细胞核；同时用ionomycin处理细胞后细胞内游离Ca²⁺浓度逐渐增高，且于5μmol/L ionomycin刺激时最高，之后随ionomycin浓度升高Ca²⁺浓度趋于平稳（P=0.000）。这一结果说明当细胞内Ca²⁺浓度升高后CacyBP/SIP转位至细胞核，且随着Ca²⁺浓度的进一步升高，CacyBP/SIP又重新分布于细胞质和细胞核。2.随BAPTA/AM刺激浓度的升高发生核转位的CacyBP/SIP又重新聚集细胞质；同时细胞内游离Ca²⁺浓度随BAPTA/AM刺激浓度的升高逐渐降低（P=0.000）。这一结果说明细胞内Ca²⁺浓度的降低可以使发生核转位的CacyBP/SIP返回细胞质。3. MTT法检测显示处理组SW480细胞的细胞存活率与未处理组无显著差异（P=0.985）；Annexin V/PI法检测也未发现明显的早期凋亡的情况（P=0.168）。这一结果说明细胞内Ca²⁺超载对本实验结果没有影响，实验结果准确可靠。4.发生核转位前后S100A1、S100A6都与CacyBP/SIP结合，但结合量及其变化明显不同；S100A1与CacyBP/SIP的结合量少，且核转位前后结合量之间的差异无统计学意义（P>0.05），这提示S100A1可能对CacyBP/SIP核转位没有影响或影响很小；但是在发生核转位后S100A6与CacyBP/SIP的结合量较转位前明显增加（P<0.05），且明显高于转位后S100A1的结合量（P<0.05），这提示S100A6可能在CacyBP/SIP的核转位中发挥了重要作用。5.通过Real-Time PCR和Western blot方法检测发现siRNA-S100A6-2组沉默效果最好，抑制率分别为87.9%和85.0%，故选用siRNA-S100A6-2干预SW480细胞，使S100A6蛋白表达受到抑制，再给予5μmol/L ionomycin刺激时，核转位受到明显抑制，CacyBP/SIP定位于细胞质和细胞核，并未完全转位至细胞核中，这进一步说明S100A6在CacyBP/SIP的核转位中发挥了重要作用。结论1.在结肠癌SW480细胞中，当细胞内Ca²⁺浓度升高后CacyBP/SIP转位至细胞核，随着Ca²⁺浓度的进一步升高，其又重新分布于细胞质和细胞核，且Ca²⁺浓度降低亦可使发生核转位的CacyBP/SIP返回细胞质，即在结肠癌SW480细胞中，随着细胞内Ca²⁺浓度的变化，CacyBP/SIP发生了进出核的转位。2.在结肠癌SW480细胞中，核转位前后S100A1、S100A6都和CacyBP/SIP结合，但前者结合量少且核转位前后结合量没有变化，这提示S100A1可能对Ca²⁺介导的CacyBP/SIP核转位没有影响或影响很小；S100A6在核转位后结合量明显增多，且抑制S100A6表达后，CacyBP/SIP核转位受到明显抑制，这提示结肠癌SW480细胞中Ca²⁺介导的S100A6与CacyBP/SIP的结合在CacyBP/SIP核转位中发挥了重要作用。