目前常用的核酸定性检测技术包括:实验室自建的In-house方法、Abbott M2000HIV-1 RNA/DNA以及AptimaHIV-1RNA核酸定性检测。常用的核酸定量检测技术包括罗氏诊断的Cobas Amplipre/Cobas TaqMan HTV-1 Testv 2.0、雅培公司的RealTime HIV-1、梅里埃公司的 Nuclisens EasyQ HIV-1 v2.0 和西门子公司的 Versant HIV-1 RNA 3.0 assay(b-DNA)。随着分子生物学技术的发展,更灵敏的核酸检测方法应运而生,包括数字PCR技术等。本研究采用Nuclisens EasyQ HIV-1核酸定量检测、PCR 荧光探针法和数字 PCR(digita1 polymerase chain reaction,dPCR)对 HIV诊断及治疗后进行了系统研究,主要包括以下三个部分:第一部分核酸定量检测采用梅里埃公司的Nuclisens EasyQ HIV-1 v2.0,直接检测血浆中HIV的RNA量。全面地分析核酸定性以及定量检测的结果,深入地探讨在实验室中,核酸定量检测用于诊断HIV的可行性以及可操作性。第二部分采用PCR-荧光探针法检测HIV患者治疗后PBMCs内HIV-1前病毒DNA的水平,探索在血浆HIV-1 RNA低于检测下限时,血细胞HIV-1前病毒作为判断抗病毒治疗疗效以及病情进展预测指标的价值,为进一步探索清除病毒的新治疗措施奠定基础。第三部分采用ddPCR、qPCR对不同月龄的HIV感染新生儿进行检测,比较两种方法的灵敏度和特异度;并评价ddPCR、qPCR两种检测方法的一致性,为制定我国的HIV暴露婴儿的实验室诊断检测策略做参考依据。第一部分核酸定量检测应用于HIV-1感染诊断的研究研究背景艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS)的病原体是人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV),2017 年 2 月,全国(不含港澳台)共报告法定传染病485649例,死亡1409例,其中AIDS死亡人数1097例(77.9%)。将HIV及时地发现并且及早期地诊断出对艾滋感染者的治疗非常紧要,重要的是它能够有效地降低患者的死亡率、并且能够将其生存的质量提高。艾滋病目前常用的检测手段主要有抗体检测和病毒检测,病毒检测主要包括p24抗原检测、细胞培养(病毒分离)以及核酸检测。抗体检测通常是在感染后3-8周才能检测出来,而核酸检测能够在感染后2周内检测出来,从而缩短窗口期。核酸检测的好处有两个即敏感性以及特异性较高,因此能够作为艾滋早期诊断的重要手段。根据《全国艾滋病检测技术规范》(2015年)修订版中的规定:检测策略补充试验包括抗体确证以及核酸试验,将核酸检测提到了艾滋病检测诊断的关键地位。定量检测能够将外周血中的HIV病毒含量测出,比定性检测更加便捷和敏感。本研究中核酸定性检测采用中国疾病预防控制中心性病艾滋病中心参比实验室自建的In-house方法,应用人类所有细胞均含有的β-actin基因作内参,当先扩增出β-actin片段后再根据巢式的方法用pol区、gag区、env区相对应的引物来扩增HIV特异性的基因片段,最终结果根据扩增产物来判定。核酸定量检测则采用梅里埃公司的Nuclisens EasyQ HIV-1 v2.0,直接检测血浆中HIV的RNA量。全面地分析核酸定性以及定量检测的结果,深入地探讨在实验室中,核酸定量检测用于诊断HIV的可行性以及可操作性。目的探讨核酸定量检测在1型艾滋病病毒(HIV-1)实验室感染诊断中的应用。对象和方法选取云南省德宏州216例样本,包括136例HIV-1阳性母亲所生活产婴儿和80例HIV-1阳性成人,分别用HIV-1核酸定性和定量方法进行检测,综合对比分析2种方法的检测结果。结果1.216例样本的核酸定性和定量检测试验一致性极好,53例样本(50例成人样本和3例婴儿样本)核酸阳性,血浆病毒载量>5000CPs/mL,随访50例成人样本的蛋白印迹试验(WB)确证均为HIV-1抗体阳性;2.163例阴性样本(30例成人样本和133例婴儿样本)核酸阴性,血浆病毒载量均低于检测下限。结论当血浆病毒载量>5000CPs/mL,核酸定量检测试验对于HIV-1感染的阳性样本是一种有效的实验室诊断方法。第二部分PCR-荧光探针法在成人HIV/AIDS接受长期HAART治疗后的应用研究研究背景人体感染HIV后可整合在宿主基因上,从而使病毒潜伏在淋巴细胞,脑细胞以及消化道淋巴组织等组织器官中,形成了病毒储存库,高效抗逆转录病毒治疗不能彻底清除人体内的病毒。病毒潜伏或潜伏病毒即病毒在被感染的细胞中暂不复制,可逃避宿主的免疫清除,但在一定的条件下可复制病毒。HAART能够很明显地降低艾滋病的病死率,也能够抑制病毒的有效复制,同时不仅将HIV/AIDS血浆中的病毒载量降低至目前现存的检测方法的最低检测水平以下,而且还能升高CD4+T细胞数量,很好地重新构建人体的免疫功能。但是,至今为止尚不能彻底治愈HIV,可能是因为人体内会持续地存在病毒储存库。本研究采用PCR-荧光探针法检测HIV患者治疗后PBMCs内HIV-1前病毒DNA的水平,拟探索在血浆HIV-1 RNA低于检测下限时,将PBMCs细胞内HIV-1前病毒水平作为判断抗病毒治疗疗效以及病情进展预测指标的价值,为进一步探索清除病毒的新治疗措施奠定基础。目的探讨PCR-荧光探针法检测成人HIV/AIDS接受高效抗逆转录病毒治疗(HAART)后HIV-1病毒储存库的改变情况及病毒储存库与治疗效果的关系。对象和方法对91例规范接受HAART治疗5-10年的HIV-1患者采集血标本进行横断面研究;通过分支DNA(bDNA)法检测血浆HIV-1RNA病毒载量;实验室自建的In-house巢式PCR、PCR-荧光探针法检测外周血HIV-IDNA水平;流式细胞术检测外周血CD4+T细胞数量;对数据进行统计学处理。结果1.91例接受5-10年HAART治疗的HIV-1患者外周血HIV-1RNA均低于检测下限(<50拷贝/ml);2.细胞中HIV-1前病毒DNA的平均含量为1.77±0.76(log10拷贝/106个细胞);3.实验室自建的In-house巢式PCR法检测细胞中HIV-1 DNA阴性者比例为39/91,不确定者比例为52/91;4.CD4+T细胞平均数量为479.56±188.11个/μl。结论PCR-荧光探针法检测经过长期HAART治疗(5-10年)成人患者的病毒储存库更加灵敏,储存库的检测对于抗病毒治疗疗效的判断以及病情进展的预测都有重要的意义。第三部分数字PCR和荧光定量PCR用于HIV婴儿早期诊断的研究研究背景HIV-l DNA可以整合到宿主DNA中,即为前病毒。而细胞内总的HIVDNA是测量储存库大小的指标。HIVDNA对于HIV的诊断、疗效监测具有很重要的意义。目前HIV DNA定量检测主要采用实时荧光定量PCR(real—time quantitation PCR,qPCR),其依赖的定量基础循环阈值(cycle threshold,Ct)受扩增效率的影响很大,故qPCR只能相对定量。微滴式数字PCR(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)是一种核酸检测和绝对定量的新方法,将样品通过微滴发生器进行微滴化处理,形成数以万计的油包水小液滴,每个液滴中含有不超过一个DNA分子,每个DNA分子均作为单独的PCR反应体系,经PCR扩增后与荧光标记探针杂交,用微滴检测器对每个反应进行检测,实现对单分子核酸的绝对定量。ddPCR技术无需建立标准曲线,且具有较高的灵敏度,但因其价格较高,所以国内还没有其在HIV定量检测方面的研究。本研究拟采用ddPCR、qPCR对不同月龄的HIV感染新生儿进行检测,比较两种方法的灵敏度和特异度,并评价ddPCR、qPCR两种检测方法的一致性;为制定我国的HIV暴露婴儿的实验室诊断检测策略做参考依据。目的比较ddPCR、qPCR对不同月龄的HIV感染新生儿检测的灵敏度与特异度,并评价ddPCR、qPCR两种检测方法的一致性。对象和方法选取2014-2016年云南、四川、新疆、重庆4省的HIV-1阳性母亲所生活产婴儿116例不同时间点干血斑(DBS)样本,根据《全国艾滋病检测技术规范》2015年修订版,本研究的金标准为连续两次核酸定性检测为阳性结果即判定为阳性。即116例婴儿干血斑样本中,有54例阳性样本,62例阴性样本。结果1.116例婴儿样本,qPCR的灵敏度为63.0%,特异度为91.9%;ddPCR的灵敏度为59.2%,特异度为75.8%;qPCR与ddPCR检测一致率为73.3%,Kappa=0.391;2.对于产后24h内的样本而言,qPCR的灵敏度为36.3%,特异度为80.0%;ddPCR的灵敏度为27.2%,特异度为73.3%;qPCR与ddPCR检测一致率为53.8%,Kappa=-0.173;3.对于产后4w内的样本,qPCR的灵敏度为50.0%,特异度为100.0%;ddPCR的灵敏度为57.1%,特异度为92.9%。qPCR与ddPCR检测一致率为78.6%,Kappa=0.478;4.对于产后6W样本,qPCR的灵敏度为78.6%,特异度为100%;ddPCR的灵敏度为78.6%,特异度为77.8%。qPCR与ddPCR检测一致率为87.5%,Kappa=0.745;5.对于产后3m样本qPCR的灵敏度为80.0%,特异度为86.7%;ddPCR的灵敏度为66.7%,特异度为60.0%。qPCR与ddPCR检测一致率为66.7%,Kappa=0.336。结论ddPCR与qPCR两种检测方法的灵敏度与特异度均不高,且两种检测方法一致性较差,暂不能作为婴儿HIV早期诊断检测的参考依据。