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研究背景及目的乳腺癌是威胁女性健康最常见的肿瘤之一,传统的治疗手段无法满足对其高复发和高转移的抑制。肿瘤细胞的恶性增殖与糖代谢的异常密切相关,与正常组织相比,肿瘤更加偏向于有氧糖酵解途径,这就是著名的“Warburg效应”。2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2DG)是针对这一特殊的能量代谢特点提出的,以抑制糖酵解限速酶为作用靶点的肿瘤治疗药物。有研究表明,仅依靠2DG对有氧酵解的抑制并未获得显著的临床抗肿瘤效果,肿瘤细胞可通过线粒体的氧化磷酸化获得能量,且2DG的毒副作用也限制了其临床的应用。声动力疗法(Sonodynamic therapy,SDT)是一种利用超声的组织穿透能力协同富集于肿瘤组织的声敏剂发挥杀伤效应的肿瘤治疗方法。本课题组的前期实验证实,线粒体是华卟啉钠(Sinoporphyrin sodium,DVDMS)介导的SDT主要的损伤靶点。因此,本论文选用4T1乳腺癌细胞为细胞模型,相应的荷瘤小鼠为动物模型,研究2DG联合DVDMS-SDT这样一种能量双靶向抑制方法的抗肿瘤效果及其杀伤机制,为乳腺癌的治疗提供新的研究方法和思路。研究方法及结果第一部分2DG联合DVDMS-SDT对乳腺癌细胞的杀伤效应采用MTT法,Caclein-AM/PI染色结合荧光显微镜观察,AnnexinV-FITC/PI凋亡分析,Western blot检测以及DCFH-DA及Rho123染色结合流式细胞仪检测了细胞存活,凋亡发生,胞内活性氧的产生以及线粒体膜电位的变化。研究结果显示:2DG联合DVDMS-SDT能显著抑制MDA-MB-231、MCF-7和4T1三种乳腺癌细胞的存活;但是对人血管内皮细胞HUVEC没有明显抑制作用,初步证明本实验的安全性和有效应。进一步Annexin V-FITC/PI凋亡检测及Western blot分析发现联合处理能显著上调Cleaved-Caspase 3的表达,诱发4T1细胞凋亡的发生。DCFH-DA及Rho123染色结果显示胞内产生大量的活性氧,显著引发线粒体膜电位的损伤,由此提示活性氧在其中扮演者重要的角色。第二部分2DG联合DVDMS-SDT对4T1乳腺癌细胞增殖、迁移的影响研究主要通过克隆形成,细胞粘附,划痕实验以及Transwell探究了 2DG联合DVDMS-SDT对4T1细胞增殖、粘附、迁移及侵袭的影响,并在此基础上采用扫描电子显微镜和流式细胞仪对细胞表面结构和周期变化进行了分析。研究结果显示:2DG联合DVDMS-SDT可以显著抑制4T1细胞增殖、粘附、迁移和侵袭的发生。此外,扫描电子显微镜结果显示2DG联合DVDMS-SDT处理后4T1细胞严重变形,微绒毛结构几乎消失;细胞周期进程发生了明显变化。推测细胞表面显微结构的破坏及细胞周期的阻滞可能会导致4T1细胞增殖及粘附、迁移和侵袭能力的减弱,进而可能影响肿瘤细胞在体内的转移。第三部分2DG联合DVDMS-SDT对4T1乳腺癌细胞代谢的影响研究首先探究了声敏剂DVDMS在4T1乳腺癌细胞中的定位;然后采用了Seahorse能量检测仪,ATP检测试剂盒结合化学发光检测仪,免疫荧光结合激光聚焦显微镜检测以及Western blot分析了 2DG联合DVDMS-SDT对细胞的氧化磷酸化水平、ATP的产生、HK2的亚细胞定位以及糖酵解关键酶的表达。研究结果显示:DVDMS主要定位在线粒体。Seahorse能量检测仪及ATP水平检测分析发现单独的2DG或DVDMS-SDT能部分抑制细胞的氧化磷酸化及ATP的产生,推测2DG联合DVDMS-SDT处理的抑制效果可能会产生叠加效应。HK2主要定位于线粒体外膜,与线粒体结合发挥其功能。激光共聚焦结果显示2DG联合DVDMS-SDT可以显著抑制HK2与线粒体结合,进而抑制细胞的糖酵解水平;免疫印迹的结果同时发现糖酵解关键酶的表达明显下调。第四部分2DG联合DVDMS-SDT对4T1移植瘤的抗肿瘤探究建立了小鼠4T1移植瘤模型,采用TUNEL凋亡检测,免疫组化分析及初步的安全性评价等手段,探究了 2DG联合DVDMS-SDT对4T1移植瘤的抗肿瘤效应及安全性。研究结果显示:2DG联合DVDMS-SDT能显著下调肿瘤组织内增殖细胞核抗原PCNA的表达,引发瘤组织损伤及凋亡,抑制4T1移植瘤的生长;免疫组化分析表明联合处理后Glut1和HK2蛋白表达明显下调,抑制了肿瘤糖酵解产能;移植瘤小鼠的肺结节数量显示2DG联合DVDMS-SDT能够显著抑制肿瘤的转移;通过对谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮的含量及主要脏器的组织形态学观察发现该处理模式具有相对较高的安全性。结论通过对2DG联合DVDMS-SDT对不同乳腺癌的细胞毒性效应、4T1细胞增殖和迁移的抑制、细胞能量代谢水平的变化以及对4T1移植瘤的抗肿瘤效应及治疗安全性等几个方面进行探究,结果显示2DG联合DVDMS-SDT是一种高效的、安全的、极具临床应用潜力的抗肿瘤模式,为乳腺癌的临床治疗提供了有价值的理论依据和实验基础。