研究背景及目的：　　 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一个可累及全身多个系统的慢性炎症性自身免疫性疾病。SLE临床表现各异,可累及皮肤、粘膜、关节、肾脏、肺、心脏、血液系统等多个系统。SLE病因不清,可能与遗传、性激素、感染及环境、机体免疫异常等多种因素有关。目前一般认为SLE的发病是激素和环境因素触发了具有遗传易感性的个体发生了免疫异常,最终导致各个脏器损伤。白细胞介素10(Interlukin-10,IL-10)是Th2类细胞因子,抑制Th1细胞产生IL-2、IFN-γ、INF-α,等细胞因子,抑制单核细胞活化及分泌细胞因子,具有免疫抑制作用;然而IL-10还可以促进人B细胞增殖并分化为分泌抗体的细胞,促进CD8+T细胞活化,又具有免疫刺激作用。近年的研究证实IL-10参与调节性T细胞的分化和功能。Llorente等最早描述了SLE患者外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMC)IL-10mRNA表达增高,而健康对照表达较少。后续的多个研究证实了IL-10mRNA和蛋白在SLE患者PBMCs中表达增高,而且几乎所有测定血清IL-10水平的研究均支持IL-10与SLE疾病活动性相关。但是其作用机制还不明确,多数研究证明IL-10促进SLE发生发展,也有的试验表明IL-10在SLE发病中具有保护作用。所以我们假设IL-10受体在SLE中可能有异常,导致IL-10作用的不一致性。　　 IL-10必须与其特异性受体结合才能发挥作用。功能性的IL-10受体包括四个亚单位,两个与配体特异性结合的α链(Interlukin-10 receptora,IL-10R1)和两个辅助信号转导的β链(Interlukin-10 receptorβ,IL-10R2)。IL-10与IL-10R1结合后,经JAK-STAT信号转导系统向细胞内传递兴奋性或抑制性信号。对小鼠IL-10R1基因编码区序列进行的DNA序列分析显示,狼疮模型小鼠NZW和MRL/1pr小鼠的IL-10R1基因共同存在多处变异,而非狼疮鼠则无相关变异,提示IL-10R1可能是一个狼疮易感基因。最近有研究表明,在欧洲白人中IL10R1有意义多态性位点G330R在SLE患者和类风湿关节炎患者中分布增高,提示其可能与SLE易感性有关。　　 关于IL-10R在SLE中表达情况及功能方面的研究较少,2003年Cairns AP等检测了SLE、类风湿关节炎患者及正常对照者外周血白细胞表面IL-10R1表达情况,结果未发现3组之间IL-10R表达有差异。Valencia-Pacheco G等用流式细胞术检测了19例SLE患者和15例健康对照PBMCs的IL-10R表达情况,结果发现SLE患者和健康对照IL-10R表达水平相似,IL-10诱导的Jak-1、Tyk-2、Star-1、Stat-3磷酸化水平也没有明显差别,但是IL-10R诱导的基因表达有显著差异,主要是凋亡相关基因和细胞因子及其受体基因。　　 为了研究IL-10R1外显子基因多态性与中国汉族SLE患者发病的相关性,我们首先对50例中国北方汉族人群IL-10R1外显子进行了基因测序,得到了中国汉族人IL-10R1外显子基因多态性的分布情况,进而筛选出分布频率大于0.1的能导致编码氨基酸改变的有义SNP位点进行了疾病相关性分析。为进一步明确IL-10R在SLE发病过程中的作用,我们还应用流式细胞术方法检测了SLE患者及正常对照者外周血细胞的IL-10R1表达情况和IL-10R信号转导通路有无异常。　　 试验方法：　　 一、病例　　 在基因相关性分析中,对309例SLE患者和303例正常对照者进行了IL-10R1外显子基因多态性检测。对28例SLE患者和14例正常对照进行了外周血细胞IL-10R1表达检测,其中14例狼疮肾炎患者,14例非狼疮肾炎。共对13例SLE患者和7例正常对照者进行了IL-10R通路的检测。　　 SLE的诊断符合1982年美国风湿病协会(ACR)制定的SLE分类标准,分类标准11项中,如有4项或4项以上诊断为SLE。正常对照者与SLE患者性别、年龄相匹配。以SLE疾病活动性指数(SLE disease activity index,SLEDAI)判定SLE疾病活动性,计分超过或等于9分为病情活动(Active),否则为非活动性(Inactive)。　　 二、DNA测序　　 采用酚氯仿法提取基因组DNA。根据IL-10R1的7个外显子分别设计引物,扩增序列包含各外显子上下游至少50个碱基对。PCR扩增、琼脂糖电泳后切胶,回收纯化,行测序PCR反应及基因测序。　　 三、IL-10R1表达　　 于早晨空腹时抽取肘静脉肝素抗凝血。标记方法如下:100ul全血细胞,分别加入不同的荧光抗体或同种型对照,室温下避光标记30分钟(min),然后红细胞裂解15min,PBS洗细胞两次,上机检测。　　 四、分离外周血单个核细胞,细胞培养　　 应用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,PBS洗两次,最后加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞,放入湿润37℃、5％CO2培养箱中进行培养。　　 五、磷酸化染色　　 调整PBMC浓度为5×105/ml,加入24孔板,在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养1小时,之后加入不同剂量的重组人IL-10或PBS(阴性对照)处理细胞,然后按照流式细胞术磷酸化染色方法进行Stat1、Stat3的磷酸化标记、检测。　　 六、细胞增殖分析　　 调整PBMC浓度为10×105/ml,加入96孔平底培养板中,培养1小时后加入IL-10或PBS处理细胞,再培养72小时后进行细胞增殖分析。增殖分析采用promage Celltiter96 AQ One solution试剂盒。以IL-10处理后细胞的吸光度与PBS处理后细胞的吸光度的比值表示细胞增值率。　　 试验结果：　　 一、中国汉族人群IL-10R1外显子多态性分布情况:　　 首先,我们对50个样本IL-10R1全部7个外显子进行了测序,结果共发现7个SNP位点,分别为位于外显子2的G254A(rs4252249),位于外显子4的A533G(rs2256111)和G599A(rs2228054),位于外显子5的A744G(rs2228055),位于外显子6的C810T,位于外显子7的C1046T(rs2229115)和A1125G(rs2229113)。其中A744G、C810T、A1125G是能够导致编码氨基酸序列改变的有义SNP位点。选择分布频率大于0.1的有义SNP位点A744G做了进一步的相关性分析。　　 二、IL-10R1 SNP位点A744G与SLE发病的相关性分析:　　 共完成了309例SLE患者和303例正常对照者IL-10R Exon5 DNA测序。结果显示正常对照组中A744G位点g等位基因分布频率为24.6％,a等位基因分布频率为75.4％,SLE患者组中g等位基因分布频率为25.6％,a等位基因分布频率为74.4％。a、g等位基因在SLE患者组和正常对照组中的分布没有差异,p=0.693。而A744A、A744G、G744G基因型在两组中的分布频率也没有差异,p=0.906,这说明此SNP位点与SLE的发病没有相关性。　　 三、IL-10R1在SLE外周血中的表达情况:　　 IL-10R1在外周血CD14+单核细胞中表达百分率和平均荧光强度最高,其次为CD8+T细胞,再次为CD4+T细胞,CD19+细胞表达最低。　　 总的SLE患者组和正常对照组相比,各细胞群内IL-10R1的表达水平没有统计学差异。但是狼疮肾炎组(LN,14例)的IL-10R1表达水平低于正常对照组(14例)和非狼疮肾炎组(14例),其中CD4+细胞群内MFI(12.8±2.9)与正常对照组(15.9±2.4)相比具有明显差异,p值为0.005。另外,活动性狼疮患者组的CD4+细胞群内IL-10R1表达水平低于稳定期狼疮患者组,MFI分别为14.0±4.0和17.6±4.7,p值为0.038。　　 CD4+T细胞和CD8+T细胞的IL-10Rl MFI与SLEDAI评分呈明显负相关(p值分别为0.007和0.004),即IL-10R1表达水平越高,其疾病活动度越低,反之,IL-10R1表达水平越低,其疾病活动度越高。而CD14+细胞的IL-10R1 MFI与SLEDAI评分无相关性。　　 四、IL-10刺激后Stat1、Stat3的磷酸化分析:　　 不加IL-10的PBMC有一部分是处于磷酸化状态的。加入IL-10刺激后,Stat1、Stat3磷酸化细胞比例及磷酸化水平均有增高,以磷酸化Stat3的增高水平显著,10ng/ml刺激15min时阳性细胞比例可达90％以上,而Stat1-P的增高水平较低。说明IL-10刺激后Stat3是主要的转录因子。　　 5ng/ml IL-10即对PBMC的Stat1、Stat3的磷酸化有刺激作用,10ng/ml IL-10刺激作用达到平台期。IL-10刺激5min时可见Stat3明显的磷酸化,正常人在15min时磷酸化水平达到高峰,30min时开始下降,而SLE患者Stat3磷酸化延迟,30min时才达高峰。　　 IL-10刺激后Stat3磷酸化水平在总SLE组与正常对照组之间没有差别。而活动性SLE组IL-10刺激后Stat3磷酸化水平,明显低于正常对照组和非活动性SLE组,p＜0.001,提示活动性SLE的IL-10R-Stat3信号转导通路有异常改变。Stat1磷酸化水平在各组中均没有差别。　　 五、IL-10对PBMC的抑制作用研究:　　 用5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml IL-10分别刺激分离培养的PBMC,72小时后检测细胞增殖率。与正常人相比,IL-10对SLE患者PBMC的抑制作用减弱,但是差别无统计学意义。　　 结论：　　 1、共发现IL-10R1外显子7个SNP位点,分布频率与欧洲白种人不同。分布频率＞0.1的有义SNP位点A744G与SLE的发病无相关性。　　 2、LN患者CD4+T细胞IL-10R1表达水平较正常对照组及非LN狼疮的患者低。CIM+和CD8+T细胞的IL-10R1表达水平与狼疮疾病活动度呈负相关。　　 3、Stat3是IL-10R信号转导通路的主要转录因子。活动性SLE患者的PBMCIL-10R-Stat3信号转导通路存在异常,表现为IL-10刺激后磷酸化反应延迟,水平较低。